Inducible Tet-Off Regulatable System: שיטה במבחנה לווסת ביטוי גנים בתאים בתרבית באמצעות מערכת טטרציקלין-אוף
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:19 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בנטילת השעיה של תאי נמען מתורבתים בשפופרת. השלם את הצינור בפלסמידים הניתנים להשראה המכילים את הגן המעניין. הביטוי של גן זה נמצא בשליטת רצף מקדם במעלה הזרם המאוחה לאופרטור טטרציקלין או TetO, ויוצר אלמנט מגיב לטטרציקלין או TRE.
בנוסף, הוסף וקטורים רגולטוריים של טטרציקלין, שכל אחד מהם מכיל גן המקודד את חלבון הטרנסאקטיבטור הרקומביננטי של טטרציקלין או tTA. אלקטרופוראט את תערובת התא-DNA כדי להשתמש בפולסים חשמליים כדי להקל על ספיגת הפלסמידים על ידי התא.
לאחר האלקטרופורציה, צלחת התאים ודגירה למשך הזמן הרצוי. עם הכניסה לגרעין, וקטור הטטרציקלין מבטא חלבון tTA. ה-tTA הוא חלבון היברידי המכיל מדכא Tet או חלק TetR ותחום טרנסאקטיבטור שעתוק VP16 נגיפי.
חלק TetR קושר את רצף ה-TetO של יסוד ה-TRE, בעוד שתחום ה-VP16 מאפשר ל-RNA פולימראז לסנתז את ה-mRNA מה-DNA במורד הזרם, מה שמוביל בסופו של דבר לביטוי גנים. החלף את מצע הגידול בצלחת התרבות במדיה המכילה דוקסיציקלין ודגר.
דוקסיציקלין - אנלוגי טטרציקלין סינטטי - נקשר לחלבון TetR ומשנה את הקונפורמציה שלו. שינוי זה משבש את האינטראקציה של חלבון TetR עם רצף TetO, ומעכב את ביטוי גן המטרה.
זרעו את התאים בגודל 1 x 106 תאים/ס"מ2 בצלחות פטרי של 100 מילימטר, בנוכחות מדיום חיוני מינימלי מלא. תרבית במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני עם ל
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים