Morpholino Mediated Gene Editing: טכניקת הפלת גנים באמצעות חסימת מורפולינו אוליגונוקלאוטידים בביצי דגי מערות חד-תאיים

מורפולינים הם אוליגונוקלאוטידים קצרים וחד-גדיליים שעוצבו מחדש עם הבדלים בעמוד השדרה של הפוספט ובמבנה הסוכר שלהם בהשוואה לנוקלאוטידים טבעיים. תכונות אלה משפרות את יציבות המורפולינוס ב-pH הפיזיולוגי. למרות הווריאציות הללו, המורפולינים מכילים את הנוקליאובסיסים הסטנדרטיים, המסייעים בתכנון אוליגונוקלאוטידים משלימים לרצף ה-mRNA הספציפי מגן מטרה רצוי שיש להפיל.

כדי לבצע עריכה גנטית מונעת מורפולינו, התחל בלקיחת ביצי דג מערות חד-תאיות המונחות בתוך הבארות של צלחת הזרקת אגרוז. דמיינו את הביצים השקופות והעגולות כדי לאתר את שק החלמון - מבנה מלא בנוזל הקיים בתוך הביצה.

קח מחט מיקרו-הזרקה מלאה מראש בתמיסה המכילה מורפולינים מעוצבים. הזריק את התמיסה ישירות לחלמון הביצה, וודא שמורפולינים נכנסים לציטופלזמה של התא. בתוך התאים, גן המטרה יוצר את ה-mRNA, המועבר לציטופלזמה.

בתוך הציטופלזמה, המורפולינו המוזרק הכלאה עם תעתיק ה-mRNA המשלים שלו באתר ההתחלה האנדוגני ומשתרע מעבר לו. תהליך זה חוסם את הקישור של תת-היחידה הגדולה יותר של הריבוזום עם קומפלקס התחלת התרגום המתהווה המורכב מתת-יחידה ריבוזומלית קטנה המורכבת עם כמה חלבונים ספציפיים.

לאחר מכן, התקדמות קומפלקס התחלת התרגום מעוכבת באופן סטרי, מה שעוצר את תרגום ה- mRNA לחלבון. לבסוף, ריכוז חלבון המטרה יורד עקב חסימה תרגומית על ידי מורפולינים.

ביום ההזרקה, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר ביציות חד-תאיות לתוך צלחת ההזרקה, ומלא עד חמש שורות של צלחת ההזרקה ב-30 עד 40 ביצים בשורה. שמור על הביצים לחות עם כמות קטנה של מי מערכת הדגים. הפשירו מורפולינו על קרח, והכינו את תמיסת ההזרקה כך ש-400 פיקוגרם של מורפולינו יוזרקו לכל ביצה, על ידי שימוש בקצה פיפטה ארוך של Microloader או הוספת בולוס של 2 עד 4 מיקרוליטר לקצה.

לאחר טעינת כל המחטים, השתמש במלקחיים כדי לקצץ את האורך העודף מקצות מחט ההזרקה, והרכיב את המחט הראשונה למיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק פיקוליטר. לאחר מכן, הניחו את צלחת ההזרקה מתחת למיקרוסקופ מנתח והשתמשו במיקרומניפולטור כדי לחדור לכל ביצה עם המחט, לפני הזרקת 1 ננוליטר של תמיסת הזרקת מורפולינו ישירות לחלמון.