JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 5:40 דק' • July 8th, 2025
התחל עם עוברי דג זברה בני קיימא בשלב חד-תאי המונחים בבארות של תבנית מיקרו-הזרקה.
טען מחט מיקרו-הזרקה עם תמיסה המכילה mRNA מקודד טרנספוזאז Tol2 ופלסמידים של תורם טרנספוזון. הפלסמידים מורכבים ממקדם דג זברה בכל מקום וגן מקודד חלבון פלואורסצנטי המוקף בזרועות טרנספוזון Tol2.
הזרקו בזהירות את תמיסת המיקרו-הזרקה לציטופלזמה של עובר דג הזברה. בתוך התא, mRNAs של טרנספוזאז Tol2 מתורגמים לחלבוני טרנספוזאז Tol2 ומועברים באופן פעיל לגרעין.
אתרי Tol2 בפלסמיד התורם מורכבים מחזרות טרמינליות הפוכות ספציפיות, או ITRs, המאגפות את הגן המדווח. ה-ITR מוקפים בחזרות קצרות וישירות. חלבוני טרנספוזאז מזהים ונקשרים לאתרי ה-ITR, ויוצרים סיכת ראש על ה-DNA האגפי. טרנספוזות מבקעות עוד יותר את מבנה הטרנספוזון מהדנ"א המאגף, משחררות אותו מהפלסמיד ומשאירות אחריהן חזרות קצרות וישירות.
טרנספוזות יוצרות שבירה כפולה מדורגת בגנום התא הסומטי ומכניסות את מבנה הטרנספוזון לאתר הגנום. מילוי הרווח של הקצוות המדורגים על ידי DNA פולימראז ואחריו קשירת החתכים יוצרים חזרות קצרות וישירות.
הקשירה גורמת לאינטגרציה יציבה של מבנה טרנספוזון בגנום התא הסומטי, והמקדם מקל על ביטוי חלבון פלואורסצנטי. דגירה על העוברים המוזרקים. במהלך ההתפתחות העוברית, תאים סומטיים מולידים סוגי תאים שונים ויוצרים דג זברה טרנסגני.
לאחר הכנת ה-mRNA של טרנספוזאז Tol2 ותמיסת ההזרקה, על פי פרוטוקול הטקסט, אחר הצהריים לפני ההזרקה, הקימו ארבעה עד שישה מיכלי רבייה עם לפחות שני זכרים ושתי נקבות. כדי להפחית את כמות פסולת הדגים, וכדי לגרום לתגובת רבייה, הימנע מהאכלת הדגים בשעות אחר הצהריים.
למחרת בבוקר, הוציאו את תמיסת ההזרקה המוכנה מהמקפיא השלילי של 80 מעלות צלזיוס, והניחו אותה על קרח. משוך את המחיצות במיכלי גידול הדגים ואפשר לדגים להזדווג. באופן כללי, דגים מטילים ביצים תוך 20 עד 30 דקות.
בזמן ההמתנה, בעזרת מושך מיקרופיפטה עם הפרמטרים הבאים, משוך מחטים מזכוכית נימית. השתמש במגבון מעבדה כדי לשבור את קצה המחט וליצור קצה משופע. קוטר קטן יותר מועדף להפחתת תמותת עוברים.
לאחר שהדגים הטילו ביצים, אספו אותן בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים. מיד מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה, הסר את כל העוברים החריגים ופסולת הדגים. לאחר מכן, פיפטה את העוברים המופרים לתבנית הזרקת אגרוז מוכנה של 3%. הסר עודפי מים כדי לעזור לשמור על העוברים במקומם.
לאחר שכל השורות מתמלאות בעוברים ברי קיימא, סדרו אותם כך שהתאים הבודדים כולם מכוונים בזווית אופקית של 45 מעלות ביחס למחט. זה יקל על ההזרקה הרבה יותר מאוחר יותר. לאחר מכן, תוך כדי לבישת כפפות, השתמש בקצה פיפטה טעינה של 20 מיקרוליטר כדי להסיר 5 מיקרוליטר מהמבנה המוכן מהצינור על הקרח.
הכנס בזהירות את קצה הפיפטה לקצה האחורי של צינור הנימים השבור למקום שבו הוא מתחיל להתחדד, כדי לקרב את המגיב לקצה ככל האפשר, ולהוציא אותו לתוך הנימים. אם עדיין יש בועות אוויר, נער את המחט והקפד לא לשבור את הקצה.
הכנס את המחט ישר לתוך מחזיק מחט המיקרו-הזרקה, והדק בזהירות עד שהמחט נשארת במקומה, ולאחר מכן, כוונן את הזווית לכ-45 מעלות. לאחר הכנת המחט וחיבורה, הפעל את המיקרוסקופ ואת מיכל לחץ הגז. כוונן את נפח ההזרקה באמצעות כ-0.5 PSI לאחיזה, ו-30 PSI לפליטה.
בדוק שהתמיסה נפלטת מהמחט בעת לחיצה על הדוושה. בעזרת מיקרומטר במה עם טיפת שמן מינרלי, התאם את נפח וזרימת התמיסה לקוטר של כ -10 מיקרומטר. ודא שהלחץ האחורי מאפשר לכמות קטנה של תמיסה לטפטף מהמחט.
אם אין מספיק לחץ אחורי, פעולה נימית תגרום לנוזל להיכנס למחט, ולהרוס את ה-mRNA. לאחר כיול המחט, הכנס את המחט לתא הבודד של העוברים המופרים על ידי שימוש בקצה חריץ הג'ל כדי לספק גיבוי ששומר על העובר במקומו, ומאפשר למחט להפעיל לחץ מבלי להזיז את העובר.
ברגע שקצה המחט נמצא בתא הבודד, לחץ על הדוושה כדי לשחרר את כמות התמיסה הרצויה. חשוב להזריק את התמיסה לתא, ולא את החלמון ליצירת דג זברה מהונדס. חזור על תהליך זה עבור כל העוברים.
בסיום, השתמש בפיפטה חד פעמית של 3.4 מיליליטר ובמים של מערכת הדגים כדי להעביר את העוברים המוזרקים לכלי מסומן על ידי שטיפתם מחריץ האגרוז. אחסן את העוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להתפתח.