אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:29 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בהשעיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, hiPSCs, במאגר אלקטרופורציה מתאים. הוסף תמיסה המורכבת מפלסמידים מקודדי טרנספוזאז של PiggyBac ופלסמידים תורמים. אלקטרופוראט את התערובת.
הפולסים החשמליים מחלחלים באופן זמני לקרומי התאים, ומקלים על ספיגה תאית של פלסמידים. הפלסמידים התורמים מורכבים מחזרות טרמינליות הפוכות ספציפיות לטרנספוזון, ITRs, שהן משלימים הפוכים זה של זה, משני צדיהם חזרות TTAA הסוגרות את חלבון המטרה וגנים עמידים לאנטיביוטיקה.
חלבוני טרנספוזאז PiggyBac מבוטאים יוצרים חריצים בקצוות 3' של ה-ITR, פנימיים לחזרות ה-TTAA. קבוצות ה-3'-הידרוקסיל החשופות תוקפות את הנוקלאוטיד של הגדיל המשלים בתוך ה-DNA המאגף, ויוצרות סיכות שיער TTAA בקצות הטרנספוזון, ובכך משחררות את מבנה הטרנספוזון מהפלסמיד.
טרנספוזות פותרות את סיכות השיער ליצירת תלויות TTAA בקצוות 5' של מבנה הטרנספוזון. טרנספוזות יוצרות עוד הפסקות דו-גדיליות ברצף ה-TTAA בגנום המארח. קצוות הטרנספוזון 3'-הידרוקסיל המשוחררים תוקפים את רצף ה-TTAA בקצוות המדורגים, וכתוצאה מכך הצטרפות קוולנטית של מבנה הטרנספוזון לגנום המארח, ומשאירים פערים חד-גדיליים המאגפים את מבנה הטרנספוזון. פערים אלה ב-DNA המארח נקשרים, מה שמוביל לאינטגרציה יציבה של מבנה הטרנספוזון.
יש לטפל ב-hiPSCs שנזרעו על צלחת מצופה חלבון מטריצה חוץ-תאית עם חומר
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים