עריכת גנים בתיווך PiggyBac transposon בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים: הליך לשילוב גן מעניין בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות מערכת PiggyBac Transposon

התחל בהשעיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, hiPSCs, במאגר אלקטרופורציה מתאים. הוסף תמיסה המורכבת מפלסמידים מקודדי טרנספוזאז של PiggyBac ופלסמידים תורמים. אלקטרופוראט את התערובת.

הפולסים החשמליים מחלחלים באופן זמני לקרומי התאים, ומקלים על ספיגה תאית של פלסמידים. הפלסמידים התורמים מורכבים מחזרות טרמינליות הפוכות ספציפיות לטרנספוזון, ITRs, שהן משלימים הפוכים זה של זה, משני צדיהם חזרות TTAA הסוגרות את חלבון המטרה וגנים עמידים לאנטיביוטיקה.

חלבוני טרנספוזאז PiggyBac מבוטאים יוצרים חריצים בקצוות 3' של ה-ITR, פנימיים לחזרות ה-TTAA. קבוצות ה-3'-הידרוקסיל החשופות תוקפות את הנוקלאוטיד של הגדיל המשלים בתוך ה-DNA המאגף, ויוצרות סיכות שיער TTAA בקצות הטרנספוזון, ובכך משחררות את מבנה הטרנספוזון מהפלסמיד.

טרנספוזות פותרות את סיכות השיער ליצירת תלויות TTAA בקצוות 5' של מבנה הטרנספוזון. טרנספוזות יוצרות עוד הפסקות דו-גדיליות ברצף ה-TTAA בגנום המארח. קצוות הטרנספוזון 3'-הידרוקסיל המשוחררים תוקפים את רצף ה-TTAA בקצוות המדורגים, וכתוצאה מכך הצטרפות קוולנטית של מבנה הטרנספוזון לגנום המארח, ומשאירים פערים חד-גדיליים המאגפים את מבנה הטרנספוזון. פערים אלה ב-DNA המארח נקשרים, מה שמוביל לאינטגרציה יציבה של מבנה הטרנספוזון.

יש לטפל ב-hiPSCs שנזרעו על צלחת מצופה חלבון מטריצה חוץ-תאית עם חומר המכיל אנטיביוטיקה. גן העמידות לאנטיביוטיקה, המונע על ידי המקדם במעלה הזרם, מאפשר בחירה של תאים ערוכים גנטית.

שטפו את תרבית ה-iPSC האנושית עם PBS נטול סידן ומגנזיום, לפני הטיפול בתאים עם מגיב דיסוציאציה של תאים למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים החלו להתנתק ממיכל התרבית, השתמש בפיפטה P1000 כדי לנתק בעדינות ידנית את התאים 3 עד 4 פעמים.

העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר, והביאו את הנפח הסופי עד 10 מיליליטר עם PBS טרי ללא סידן ומגנזיום, לספירה. אסוף 1 x 10⁶ תאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר R מערכת האלקטרופורציה.

הוסף 4.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד וקטורי הניתן להעברה, ו-0.5 מיקרוגרם של ה-DNA של פלסמיד טרנספוזאז PiggyBac לצורך טרנספקציה. בצע טרנספקט עם מערכת האלקטרופורציה של התאים בהתאם להוראות היצרן, עם הפרמטרים המצוינים. ולאחר מכן. זרע את התאים במדיום iPSC אנושי בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי Y-27632 בצלחת מצופה מטריצה של 6 מילימטר.