CRISPR Concatemer-Mediated Multiple Gene Knockout: טכניקה להעלמת גנים מרובים בו-זמנית על ידי מסלול חיבור קצה לא הומולוגי בתאי מעיים של עכבר

כדי להפיל בו זמנית מספר גנים באמצעות מערכת CRISPR-concatemer-Cas9, התחל עם צינור המכיל את תרחיף תאי המעי של העכבר. השלם את הצינור עם וקטורים של CRISPR-concatemer המכילים את קלטת הביטוי עבור RNA מנחים מרובים, או gRNAs, המשולבים זה בזה.

כל קלטת gRNA מעוצבת בהתאמה אישית כדי להפיל בנפרד את הגן המיועד. הוסף וקטורי ביטוי המקודדים אנדונוקלאז Cas9 לאותו צינור. אלקטרופוראט את תערובת התא-פלסמיד - טכניקה המשתמשת בזרם חשמלי כדי להקל על כניסת פלסמידים לתא. בתוך התא, הביטוי המשותף של ה-CRISPR-concatemer וה-Cas9 יוצר רצפי gRNA ונוקלאזות Cas9, בהתאמה.

כל רצף gRNA נקשר לאנזים Cas9 המתאים, ויוצר קומפלקסים מרובים של Cas9-gRNA המתחברים לאתרי המטרה בגנום המארח. קישור זה מפעיל את האנזים Cas9, המייצר חתך בשני גדילי ה-DNA במעלה הזרם לאתר המוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר, או PAM. התוצאה היא שבירה של גדיל כפול, או DSB, ב-DNA המטרה.

בהיעדר רצף הומולוגי לגן המטרה, מופעל מנגנון התיקון האנדוגני של התא, הנקרא חיבור הקצה הלא הומולוגי, המאפשר לחלבוני התיקון ולמולקולות הקינאז להיקשר באתר השבירה. מאוחר יותר, האנזים ליגאז מתקן את ה-DSB, וכתוצאה מכך שינויים ברצף גן המטרה. שינויים אלה משבשים את תפקוד הגנים, וכתוצאה מכך נוקאאוט של גנים מרובים.

התחל הליך זה על ידי הוספת 9 מיליליטר של מדיום סרום מופחת לצינור של 15 מיליליטר המכיל את תרחיף התא, וצנטריפוגה ב-400G למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את כל הסופרנטנט, והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת אלקטרופורציה. הוסף כמות כוללת של 10 מיקרוגרם DNA לשני צינורות חדשים. לאחר מכן, הוסף תמיסת אלקטרופורציה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר ושמור את תערובת התא-DNA על קרח.

העבירו את תערובת התא-DNA לקוביית האלקטרופורציה. הנח את הקובט בתא האלקטרופורטור. מדוד את העכבה על ידי לחיצה על הכפתור המתאים באלקטרופורטור, וודא שהוא 0.030 עד 0.055 אוהם. בצע אלקטרופורציה בהתאם להגדרות המצוינות בפרוטוקול הטקסט. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה בתוספת מעכב ROCK לקובטה, ולאחר מכן העבר את כל תכולתו לצינור של 1.5 מיליליטר.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש. לאחר 30 דקות, סובב בחום של 400 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -20 מיקרוליטר לבאר של מטריצת מרתף. זרע כ-1 x 10⁴ עד 1 x 10⁵ תאים לבאר בצלחת של 48 בארות, והוסף EGF בתוספת מעכב Noggin GSK-3, מעכב ROCK ומדיום דימתיל סולפוקסיד 1.25%. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.