CRISPR Concatemer-Mediated Multiple Gene Knockout: טכניקה להעלמת גנים מרובים בו-זמנית על ידי מסלול חיבור קצה לא הומולוגי בתאי מעיים של עכבר

כדי להפיל בו זמנית מספר גנים באמצעות מערכת CRISPR-concatemer-Cas9, התחל עם צינור המכיל את תרחיף תאי המעי של העכבר. השלם את הצינור עם וקטורים של CRISPR-concatemer המכילים את קלטת הביטוי עבור RNA מנחים מרובים, או gRNAs, המשולבים זה בזה.

כל קלטת gRNA מעוצבת בהתאמה אישית כדי להפיל בנפרד את הגן המיועד. הוסף וקטורי ביטוי המקודדים אנדונוקלאז Cas9 לאותו צינור. אלקטרופוראט את תערובת התא-פלסמיד - טכניקה המשתמשת בזרם חשמלי כדי להקל על כניסת פלסמידים לתא. בתוך התא, הביטוי המשותף של ה-CRISPR-concatemer וה-Cas9 יוצר רצפי gRNA ונוקלאזות Cas9, בהתאמה.

כל רצף gRNA נקשר לאנזים Cas9 המתאים, ויוצר קומפלקסים מרובים של Cas9-gRNA המתחברים לאתרי המטרה בגנום המארח. קישור זה מפעיל את האנזים Cas9, המייצר חתך בשני גדילי ה-DNA במעלה הזרם לאתר המוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר, או PAM. התוצאה היא שבירה של גדיל כפול, או DSB, ב-DNA המטרה.

בהיעדר רצף הומולוגי לגן המטרה, מופעל מנגנון התיקון האנדוגני של התא, הנקרא חיבור הקצה הלא הומולוגי, המאפשר לחלבוני התיקון ולמולקולות הקינאז להיקשר באתר השבירה. מאוחר יותר, האנזים ליגאז מתקן את ה-DSB, וכתוצאה מכך שינויים ברצף גן המטרה. שינויים אלה משבשים את תפקוד הגנים, וכתוצאה מכך נוקאאוט של גנים מרובים.

התחל הליך זה על ידי הוספת 9 מיליליטר של מדיום סרום מופחת לצינור של 15 מיליליטר המכי