בדיקת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי: שיטה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן במיטוכונדריה מבודדים

מיטוכונדריה לוקחת סידן ציטוזולי מכיוון שהוא חיוני לתפקודם התקין.

זרם סידן מוגזם למטריצה המיטוכונדריאלית - עומס יתר של סידן מיטוכונדריאלי - מפעיל את פתיחת תעלת הממברנה הפנימית, נקבוביות מעבר החדירות המיטוכונדריאלית או MPTP. הנקבוביות הפתוחות מאפשרות פליטת סידן מוגברת מהמיטוכונדריה, מה שגורם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.

כדי למדוד את ספיגת הסידן המיטוכונדריאלית, התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה מיטוכונדריה מבודדת התלויה במאגר מתאים. השלם את הבאר עם פירובט ומלאט, שהם מצעים המייצרים ATP. מערבבים את תכולת הבאר ודוגרים.

במהלך הדגירה, פירובט ומלאט מומרים ל-ATPs, וממריצים את המיטוכונדריה. הוסף תמיסה המכילה מולקולות צבע פלואורסצנטיות אטומות לממברנה המיטוכונדריאלית ורגישות לסידן. העבירו את המאגר המכיל סידן למיטוכונדריה האנרגטית.

עקוב אחר פלואורסצנטיות הסידן של הצבע כאשר מולקולות הצבע נקשרות לסידן החופשי במאגר.

הוסף עוד יוני סידן כדי להתחיל זרם סידן מיטוכונדריאלי. הסידן המיטוכונדריאלי הגדל בהדרגה מפחית את יוני הסידן במאגר, ומפחית את פלואורסצנטיות הסידן של הצבע.

ברגע שהמיטוכונדריה מגיעים ליכולת נשיאת הסידן המקסימלית שלהם, הוספה נוספת של יוני סידן פותחת את תעלות ה-MPTP ומייבאת סידן למאגר. סידן המאגר נקשר למולקולות הצבע, וגורם לפלואורסצנטיות מוגברת של סידן בצבע.

שרטט את הקרינה של הצבע בנקודות זמן שונות של תוספת סידן כדי לנטר את הקינטיקה של ספיגת הסידן המיטוכונדריאלית.

כדי להתחיל במדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלית באמצעות קורא צלחות, תכנת את הקורא לבצע קריאה קינטית של סידן ירוק-5N פלואורסצנטי בכל שנייה, למשך זמן כולל של 1,000 שניות.

תכנת את מזרקי המגיב להוציא 5 מיקרוליטר של תמיסת סידן כלורי בנקודות זמן שונות. לאחר מכן, יש להניח את המזרקים בתמיסת הסידן כלוריד שתשתמש בה.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוגרם של מיטוכונדריה מבודדת לבאר אחת של צלחת של 96 בארות, והוסף את הנפח המתאים של מאגר אשלגן כלורי כדי להשיג נפח כולל של 197 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסיפו 1 מיקרוליטר של 1 פירובט טוחן, 1 מיקרוליטר של 500 מיליליטר מלאט ו-1 מיקרוליטר של 1 מילי-מולרי סידן ירוק-5N, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג.

דגירה מוגנת מאור בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, כדי שהמיטוכונדריה תתמלא באנרגיה. לבסוף, התחל את הפרוטוקול הקינטי המתוכנת מראש, ועקוב אחר הקרינה של סידן ירוק-5N.