בדיקת דליפת פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה פפטידית חודרת תאים עם ממברנה

פפטידים חודרי תאים, CPPs, פפטידים קצרים וטעונים חיובית, יכולים לקיים אינטראקציה עם ממברנות תאיות ולחצות אותן, ולהקל על העברת מטענים אטומים לתאים.

כדי לחקור את פוטנציאל חדירת הממברנה של CPP בדיקה במבחנה באמצעות חיקוי קרום התא, התחל עם שלפוחית חד למלרית גדולה, LUV, תרחיף

LUVs מורכבים משכבה דו-שכבתית פוספוליפידית עמוסה בבדיקה פלואורסצנטית אטומה לממברנה וזוג מרווה מתאים. בתוך השלפוחית, המרווה מקיים אינטראקציה עם הגשושית הפלואורסצנטית בשל קרבתם וגורם לכיבוי הקרינה.

פיפט את מתלה ה-LUV לקובט פלואורסצנטי קוורץ, ודלל באמצעות חיץ. הוסף פס מגנטי. מעבירים לספקטרופלואורומטר תוך ערבוב מגנטי למניעת שקיעת LUV במהלך הריצה. קבע את הקרינה ברקע כדי למנוע דליפות LUV.

הוסף את הריכוז הרצוי של CPP לתרחיף LUV במרווחי זמן קבועים.

בהתבסס על ההידרופוביות והמטען של שאריות חומצות האמינו של ה-CPPs, הם מפריעים לקרום השומנים LUV, מה שמוביל לחדירת הממברנה וחדירה.

הנזק לקרום השלפוחית גורם לדליפה של הגשושית הפלואורסצנטית והמרווה לתוך התמיסה שמסביב, מה שמגדיל את ההפרדה המרחבית שלהם. כתוצאה מכך, הגשושית מציגה פלואורסצנטיות.

תוספת נוספת של תמיסת CPP מובילה לחדירות מוגברת של LUV ועוצמת הקרינה. עלייה בעוצמת הקרינה עם תוספת CPP מרמזת על פוטנציאל החדירה של הממברנה של הפפטיד.

כדי למדוד את דליפת הקרינה, יש לדלל את ה-LUVs ב-1 מיליליטר של HEPES Buffer 2 בקובט פלואורסצנטי קוורץ לריכוז סופי של 100 מיקרו-מולרי, ולהוסיף מערבל מגנטי כדי להקל על הומוגניזציה של התמיסה במהלך הניסוי.

מדוד את ה-LUVs לבד במהלך 100 השניות הראשונות כדי להעריך את הקרינה ברקע, לפני מדידת הדליפה כעלייה בעוצמת הקרינה עם הוספת תמיסת פפטיד במהלך 900 השניות הבאות.

כדי למדוד דליפת פלואורסצנטיות של 100% כבקרה חיובית, הוסף 1 מיקרוליטר של Triton X-100 ל-LUVs כדי להמיס את השלפוחית, וכתוצאה מכך להפסיק לחלוטין את הגשושית במהלך 100 השניות האחרונות של הניתוח. לאחר מכן, השתמש בנוסחה כדי לחשב את אחוז הדליפה בכל נקודת זמן.