אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:34 דק׳ • July 8th, 2025
PCR טיפתי דיגיטלי מזהה מוטציות אינדל - החדרה או מחיקה אקראית של נוקלאוטידים ב-DNA. זה מושג על ידי חלוקת הדגימה לטיפות זעירות והגברה עצמאית של ה-DNA בכל טיפה.
כדי לבצע ddPCR, קח דגימת DNA המכילה וריאציות פראיות ומוטנטיות של גן המטרה. טען את תערובת הדגימה והשמן לתאים נפרדים של תא מחולל הטיפות המכילים את התעלה המיקרופלואידית.
הדגימה והשמן זורמים במהירות דרך התעלות הצרות, מתחלבים בצומת, ומחולקים למספר טיפות, שכל אחת מהן מכילה כמה מולקולות DNA.
כעת, קח לוחית PCR עם המאגר המכיל פריימרים קדימה ואחורה, dNTPs, DNA פולימראז יציב בחום ושתי בדיקות המתויגות עם פלואורופורים ומולקולות מרווה שונות. כל בדיקה היא ספציפית לסוג מסוים של אלל - סוג פרא או מוטנטי.
מעבירים את הטיפות לצלחת ה-PCR. הנח את הצלחת במחזור תרמי והפעל את התגובה. במהלך דנטורציה, גדילי ה-DNA נפרדים. בטמפרטורת חישול, הפריימרים והבדיקות מחסלים ל- DNA של התבנית.
הגשושית עם פלואורופורים ירוקים וכתומים נקשרת לרצף ה-DNA מסוג הבר והמוטנטי בהתאמה. מאוחר יותר, DNA פולימראז מרחיב את הפריימרים, מבקע את מולקולות הפלואורופור והמרווה מהגשושית, ויוצר אות פלואורסצנטי.
נתח את המוצר המוגבר. הטיפות המציגות פלואורסצנטיות ירוקות מכילות את רצף ה-DNA מסוג הבר, בעוד שהפלואורסצנציה הכתומה מצביעה על מוטציית האינדל.
ראשית, הכינו 25 מיקרוליטר של תערובת הדגימה
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים