תגובת שרשרת פולימראז הדרגתית לקביעת טמפרטורת החישול האופטימלית

תגובת שרשרת פולימראז שיפוע היא טכניקה לייעול טמפרטורת החישול שבה פריימרים - DNA ספציפי לרצף, חד-גדילי - נקשרים לאתרים המשלימים ב-DNA של התבנית.

קח תערובת המכילה פריימרים קדימה ואחורה, dNTPs ו-DNA פולימראז יציב בחום במאגר מתאים. הוסף את ה-DNA של התבנית והעביר את המרכיבים ללוחית PCR.

הניחו את הצלחת במחזור תרמי שיפוע עם בלוק חימום מיוחד. זה קובע שיפוע ליניארי של טמפרטורת חישול בין הטווח של 55 מעלות צלזיוס ל-65 מעלות צלזיוס, עם עלייה עקבית בטמפרטורה בכל הצלחת.

התגובה מחממת את הצלחת בטמפרטורה גבוהה, מפרקת את ה-DNA הדו-גדילי לגדילים בודדים ומפעילה את ה-DNA פולימראז. מאוחר יותר, הטמפרטורה יורדת על פי הערכים המתוכנתים בכל באר, מה שמקל על חישול פריימר.

בטמפרטורת חישול מתחת לאופטימלית, הפריימרים נקשרים באופן לא ספציפי ל-DNA המפורק, מה שמוביל להגברה לא ספציפית במהלך תגובת ה-PCR. בטמפרטורה מעל האופטימלית, כמויות לא מספיקות של הפריימרים נקשרות ל-DNA.

בטמפרטורה אופטימלית, הפריימרים נקשרים במיוחד ל-DNA המטרה. לאחר מכן, הטמפרטורה עולה מעט, ומאפשרת לפולימראז להאריך את הפריימרים באמצעות dNTPs. מחזורי דנטורציה, חישול והארכה חוזרים ונשנים אלה מובילים להגברת DNA.

נתח את המוצר בכל באר. הבארות עם טמפרטורות חישול לא אופטימליות מראות הגברה פחות או לא ספציפית.

טמפרטורת חישול אופטימלית מייצרת את ההגברה הספציפית המקסימלית של ה-DNA.

כדי לבצע PCR הדרגתי, התחל בהכנת תערובת מאסטר. לאחר מכן, הסר 19 מיקרוליטר מתערובת המאסטר עבור הבקרה שאינה תבנית, או NTC, בצלחת של 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו את התבנית למיקס המאסטר הנותר. Aliquot 20 מיקרוליטר מהדגימה מערבבים לצלחת 96 בארות. בצע PCR בעקבות פרמטרי המחזור, ולאחר מכן צור את פרופילי ההיתוך התרמי, תוך שימוש בפרמטרים המוזכרים בכתב היד.