PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 8:45 דק׳ • July 8th, 2025
תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית דופלקס - ddPCR - מאפשרת זיהוי כמותי בו זמנית של שני סמנים גנטיים נפרדים.
כדי להתחיל, קחו דגימה שמכילה שני רצפי מטרה שונים. הוסף תערובת המכילה אנזים DNA פולימראז יציב בחום, dNTPs ופריימרים ספציפיים למטרה. לאחר מכן, הוסף שתי בדיקות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות למטרה, המסומנות עם מדווחים פלואורסצנטיים ומולקולת מרווה לאיתור מטרות מוגברות.
התמיסה מתחלבת בשמן כדי לחלק את רצפי המטרה לננו-טיפות רבות. כל טיפה המכילה את המטרה פועלת ככלי תגובה אינדיבידואלי.
התחל את תהליך המחזור התרמי עבור תגובת ההגברה בתוך הננו-טיפות הבודדות.
בטמפרטורת דנטורציה גבוהה, המטרות הדו-גדיליות נפרדות לגדילים בודדים.
הורד את הטמפרטורה כדי להגיע לטמפרטורת החישול המתאימה, מה שמאפשר לפריימרים ולבדיקות האוליגונוקלאוטידים להיקשר לתבנית.
קרבתו של המרווה מדכאת את הקרינה של המדווח. בטמפרטורת ההרחבה, DNA פולימראז מרחיב את הפריימרים ומבקע את בדיקת האוליגונוקלאוטיד. הכתב הלא כבול פולט פלואורסצנטיות.
העבירו את הטיפות דרך קורא טיפות - מערכת לזיהוי פלואורסצנטיות. זיהוי פלואורסצנטי יחיד או כפול מצביע על טיפות חיוביות המכילות מטרות, בעוד שהיעדר אות מצביע על טיפות שליליות.
היחס בין טיפות חיוביות למספר הכולל של מחיצות קובע את הריכוז הראשוני של רצפי המטרה.
כדי להתחיל בהליך זה, ראשית, הכינו 100 ריכוזי מלאי מי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים