JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:08 דק' • July 8th, 2025
PCR שעתוק הפוך כמותי בזמן אמת שימושי לזיהוי זיהומים ויראליים.
התחל עם דגימה המכילה את ה-RNA הנגיפי המטרה. הוסף פריימרים ספציפיים למטרה - המסייעים הן בסינתזת DNA והן בהגברה - יחד עם אנזים טרנסקריפטאז הפוך ו- dNTPs.
הוסף DNA פולימראז יציב בחום - אנזים להגברת DNA על פני מחזורי PCR - ו- SYBR ירוק - צבע שמשתלב ל- DNA דו-גדילי, dsDNA. הנח את התגובה במחזור תרמי. הגדר טמפרטורה מתאימה לפריימרים להיקשר ל-RNA המטרה.
הטרנסקריפטאז ההפוך מוסיף dNTPs לפריימר ובמקביל מבקע את התבנית RNA, מסנתז cDNA.
העלה את הטמפרטורה, ומשבית את הטרנסקריפטאז ההפוך. הורד את הטמפרטורה, ואפשר לפריימרים לחשל ל- cDNA להגברה שלאחר מכן. הגדל את הטמפרטורה כדי להגיע לשלב ההארכה, שבו ה-DNA פולימראז מרחיב את הפריימרים, מסנתז dsDNA.
מחזורים עוקבים מביאים להגברה אקספוננציאלית של dsDNA. ירוק SYBR נקשר ל-DNA במספרים הולכים וגדלים, וגורם לעלייה פרופורציונלית בפליטת הקרינה. שרטט את אות הקרינה שזוהה על פני המחזורים.
עקומת הגברה חיובית מצביעה על נוכחות של RNA ויראלי בדגימה.
הגדל את הטמפרטורה בהדרגה כדי להגיע לטמפרטורת ההיתוך, תוך דנטורציה של ה-dsDNA לגדילים בודדים. מולקולות הצבע הקשורות משתחררות - ומאבדות את הקרינה שלהן. שרטט את הקרינה היורדת כנגד הטמפרטורה.
שיא המתאים לטמפרטורת ההיתוך הספציפית לנגיף מאשר זיהום נגיפי.
תכנן את פריסת לוחית ה-PCR שלך עם גיליון אלקטרוני, תוך התחשבות הן בדגימות הבדיקה והן בדגימות הבקרה. הכן תחנת עבודה PCR על ידי חיטוי משטחים, ואם אתה משתמש בארון UV, הפעל את אור ה-UV 10 דקות לפני ההתחלה.
הוציאו ריאגנטים ופריימרים מהמקפיא כדי להפשיר, אך שמרו את תערובת האנזימים על קרח כל הזמן. מערבבים את הריאגנטים והצנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את הנוזל. הכן תערובות מאסטר PCR עבור ליסה וירוס ובטא-אקטין, בהתאם להוראות כתב היד. השאירו את המאסטר-מיקס על קרח עד שהם מוכנים לשימוש. מערבבים וצנטריפוגה את תערובות המאסטר המוכנות, ומוציאים 19 מיקרוליטר לבארות הרלוונטיות של רצועת הצלחת או הצינור התואמת למכונת PCR.
בחדר נפרד או בארון UV, הוסיפו בזהירות 1 מיקרוליטר מה- RNA המוכן. אם אתה משתמש בארון UV, הפעל את אור ה-UV 10 דקות לפני ההתחלה. לאחר דגימות הבדיקה, הוסף את הפקד החיובי ואת הפקד ללא תבנית.
בעת הוספת ה-RNA לתערובות המאסטר, ודא שהוא מתווסף לבאר הנכונה. השתמש בתוכנית הצלחת כדי לסייע בשלב זה.
אטמו את הצלחת, בדקו שהמכסים שטוחים על פני הצלחת, וסובבו אותה כלפי מטה כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הבארות. ודא שלכל באר יש את אותו נפח נוזל ואין בועות נראות לעין. לאחר מכן, העבירו את הדגימות למכונת ה-PCR.
פתח את התוכנית, בחר 'SYBR Green' עם 'דיסוציאציה'. בחר את הבארות לניתוח, ובחר "לא ידוע" כסוג הדגימה ו- "SYBR" כצבע הפלורסנט. סמן את הבארות בפריסת הצלחת עם המידע לדוגמה, כולל אם הבדיקה מיועדת לבאר Lyssavirus או לבטא-אקטין.
לחץ על "הגדרת פרופיל תרמי" ושנה את תנאי הרכיבה התרמית כמפורט בכתב היד. לחץ על "התחל" ולאחר מכן, בחר מיקום לשמירת הקובץ וסמן את התיבה כדי לכבות את המנורה בסוף הריצה. כאשר מופיעה האפשרות להתחיל לפני חימום המנורה, לחץ על "הפעל עכשיו", אך ודא שלמנורה יש פחות מ -15 דקות להתחמם.