אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:08 דק׳ • July 8th, 2025
PCR שעתוק הפוך כמותי בזמן אמת שימושי לזיהוי זיהומים ויראליים.
התחל עם דגימה המכילה את ה-RNA הנגיפי המטרה. הוסף פריימרים ספציפיים למטרה - המסייעים הן בסינתזת DNA והן בהגברה - יחד עם אנזים טרנסקריפטאז הפוך ו- dNTPs.
הוסף DNA פולימראז יציב בחום - אנזים להגברת DNA על פני מחזורי PCR - ו- SYBR ירוק - צבע שמשתלב ל- DNA דו-גדילי, dsDNA. הנח את התגובה במחזור תרמי. הגדר טמפרטורה מתאימה לפריימרים להיקשר ל-RNA המטרה.
הטרנסקריפטאז ההפוך מוסיף dNTPs לפריימר ובמקביל מבקע את התבנית RNA, מסנתז cDNA.
העלה את הטמפרטורה, ומשבית את הטרנסקריפטאז ההפוך. הורד את הטמפרטורה, ואפשר לפריימרים לחשל ל- cDNA להגברה שלאחר מכן. הגדל את הטמפרטורה כדי להגיע לשלב ההארכה, שבו ה-DNA פולימראז מרחיב את הפריימרים, מסנתז dsDNA.
מחזורים עוקבים מביאים להגברה אקספוננציאלית של dsDNA. ירוק SYBR נקשר ל-DNA במספרים הולכים וגדלים, וגורם לעלייה פרופורציונלית בפליטת הקרינה. שרטט את אות הקרינה שזוהה על פני המחזורים.
עקומת הגברה חיובית מצביעה על נוכחות של RNA ויראלי בדגימה.
הגדל את הטמפרטורה בהדרגה כדי להגיע לטמפרטורת ההיתוך, תוך דנטורציה של ה-dsDNA לגדילים בודדים. מולקולות הצבע הקשורות משתחררות - ומאבדות את הקרינה שלהן. שרטט את הקרינה היורדת כנגד הטמפרטורה.
שיא המתאים לטמפרטורת ההיתוך הספציפית לנגיף מאשר זיהום נגיפי.
תכנן את פריסת לו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים