תגובת שרשרת כמותית של פולימראז לספירת בקטריופאג'ים

כדי לספור בקטריופאג'ים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית, qPCR, השג קוקטייל תגובת qPCR המכיל Taq DNA פולימראז, פריימרים, טריפוספטים דאוקסינוקלאוטידים - dNTPs - ומולקולות צבע מדווח פלואורסצנטי במאגר אופטימלי. מעבירים לבארות של צלחת qPCR.

הוסף בקטריופאג'ים שטופלו בחום. טיפול בחום משחרר DNA בקטריופאג'ים מחלקיקי בקטריופאג'ים. אוטמים את הצלחת ומונעים אידוי תערובת. טען את הצלחת למערכת qPCR, תוך הגדרת תנאי רכיבה מתאימים.

חימום לטמפרטורות גבוהות מנטרל את הדנ"א הדו-גדילי לגדילים בודדים. זה גם מפעיל את ה-Taq DNA פולימראז. חישול גורם לפריימרים ספציפיים לרצף להיקשר לגדילי ה-DNA המשלימים של הבקטריופאג'ים. הרחבה מאפשרת ל-Taq DNA פולימראז מופעל להוסיף dNTPs לקצה ה-3' של הפריימר, ולהרחיב את גדיל ה-DNA הגדל בכיוון 5' עד 3'.

מולקולות הצבע משתלבות ב-DNA הדו-גדילי החדש שסונתז, וגורמות לעוצמת הקרינה המוגברת. כל מחזור PCR מכפיל את כמות ה-DNA היעד, ומגדיל את עוצמת הקרינה.

קבע את ערך מחזור הסף, Ct, שבו הקרינה הנמדדת עולה על רמת הרקע.

ערך ה-Ct קשור הפוך לכמות ה-DNA ההתחלתית, כאשר כל גנום בקטריופאג'ים שווה ערך לחלקיק בקטריופאג'ים אחד, מה שמקל על כימות בקטריופאג'ים מהעקומה הסטנדרטית של ה-DNA של הבקטריופאג'ים.

לאחר הגברה, בצע ניתוח עקומת התכה, והגדל בהדרגה את טמפרטורת התגובה. בטמפרטורת התכה מסוימת, מחצית מהדנ"א נפרד לגדילים בודדים, משחרר מולקולות צבע וגורם לירידה פלואורסצנטית פתאומית.

טמפרטורת התכה מובהקת, ייחודית למוצר ה-qPCR, מאמתת את ספציפיות המוצר.

הכן את ה-qPCR premix עבור 10 דגימות פאג'ים ביו-פאן בריכוז לא ידוע ו-7 דגימות בריכוזים סטנדרטיים במשולש, וכתוצאה מכך תערובת מוקדמת ל-51 דגימות המכילות 255 מיקרוליטר של qPCR Master Mix, 51 מיקרוליטר פריימרים ו-102 מיקרוליטר מים.

Aliquot 8 מיקרוליטר מתערובת ה-PCR המוכנה ל-51 בארות של צלחת qPCR של 96 בארות. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של דגימות פאג' T7 שטופלו בחום לכל אחת מהבארות הללו, והוציאו אותם מתחת לפני השטח של תערובת ה-qPCR. בעזרת סרט דבק, אטום את הצלחת.

עטפו את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למזער את ההלבנה הקרינה, ולאחר מכן, המשיכו להפעיל את הצלחת על ציוד ה-qPCR. הגדר את תנאי הרכיבה והגדרות עקומת ההיתוך כמתואר בפרוטוקול הטקסט.