תגובת שרשרת כמותית של פולימראז לספירת בקטריופאג'ים

כדי לספור בקטריופאג'ים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית, qPCR, השג קוקטייל תגובת qPCR המכיל Taq DNA פולימראז, פריימרים, טריפוספטים דאוקסינוקלאוטידים - dNTPs - ומולקולות צבע מדווח פלואורסצנטי במאגר אופטימלי. מעבירים לבארות של צלחת qPCR.

הוסף בקטריופאג'ים שטופלו בחום. טיפול בחום משחרר DNA בקטריופאג'ים מחלקיקי בקטריופאג'ים. אוטמים את הצלחת ומונעים אידוי תערובת. טען את הצלחת למערכת qPCR, תוך הגדרת תנאי רכיבה מתאימים.

חימום לטמפרטורות גבוהות מנטרל את הדנ"א הדו-גדילי לגדילים בודדים. זה גם מפעיל את ה-Taq DNA פולימראז. חישול גורם לפריימרים ספציפיים לרצף להיקשר לגדילי ה-DNA המשלימים של הבקטריופאג'ים. הרחבה מאפשרת ל-Taq DNA פולימראז מופעל להוסיף dNTPs לקצה ה-3' של הפריימר, ולהרחיב את גדיל ה-DNA הגדל בכיוון 5' עד 3'.

מולקולות הצבע משתלבות ב-DNA הדו-גדילי החדש שסונתז, וגורמות לעוצמת הקרינה המוגברת. כל מחזור PCR מכפיל את כמות ה-DNA היעד, ומגדיל את עוצמת הקרינה.

קבע את ערך מחזור הסף, Ct, שבו הקרינה הנמדדת עולה על רמת הרקע.

ערך ה-Ct קשור הפוך לכמות ה-DNA ההתחלתית, כאשר כל גנום בקטריופאג'ים שווה ערך לחלקיק בקטריופאג'ים אחד, מה שמקל על כימות בקטריופאג'ים מהעקומה הסטנדרטית של ה-DNA של הבקטריופאג'ים.

לאחר הגברה, בצע ניתוח עקומת התכה, והגדל בהדרגה את טמפרטורת התגובה. בטמפרטורת התכה מסוימת, מחצית מה