אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:02 דק׳ • July 8th, 2025
Microsphere-PCR משתמש בכדור בגודל מיקרו המחובר לאוליגונוקלאוטידים על פני השטח שלהם, מה שמאפשר הגברה מועדפת של DNA חד-גדילי.
כדי להתחיל מיקרוספרה-PCR, קח תערובת תגובה המכילה גדילי DNA חד-גדיליים, פריימרים קדימה עם תג נוקלאוטיד נוסף, פולימראז DNA יציב תרמית, dNTPs ומיקרוספירות המציגות בדיקות אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליות.
הנח את הצינור במחזור תרמי, והפעל בתנאים שהוגדרו.
במחזור הראשון, בטמפרטורת החישול, ה-DNA של התבנית נקשר לבדיקה על פני המיקרוספירה כך שה-DNA של התבנית מתפקד כגדיל החישה. במהלך ההרחבה, הפולימראז מרחיב את הדנ"א, והדופלקס נשאר מחובר למיקרוספרה.
במחזור הבא, במהלך דנטורציה, ה-DNA של התבנית נפרד מהמיקרוספרה, ומשאיר את גדיל הגשושית קשור לפני השטח - ומשמש כתבנית לגדיל חדש.
במהלך החישול, הפריימר המתויג נקשר לגדיל האנטיסנס. מאוחר יותר, הפולימראז מרחיב אותו כדי לסנתז את גדיל החישה עם תג הנוקלאוטיד.
חזור על המחזור מספר פעמים כדי ליצור עותקים מרובים של DNA חד-גדילי חישתי, הנכנסים לתמיסה, בעוד המזהמים הדו-גדיליים נשארים מחוברים.
העבר את מוצרי ה-PCR לצינור המכיל מאגר טעינה. טען את המוצר והסמנים לבארות שונות של הג'ל, והפרד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
ה-DNA של התבנית יוצר פס קלוש במשקל מולקולרי נמוך, בעוד שפס אינטנסיבי במשקל מולקולרי גבוה מאשר הגברת DNA חד-גדילית.
השג כ-25 מיקרוספירות באמצעות ספירה מיקרוסקופית באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה פי 40. לאחר מכן, שלב את כל הריאגנטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הנח את הדגימות לתוך תרמו-סייקלר והפעל את ה-PCR הא-סימטרי בתנאים המתאימים.
איסוף הסופרנטנט לאחר PCR סימטרי הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר מכיוון שזהו תהליך מרכזי ליצירת DNA חד-גדילי עם מיקרוספרות.
לאחר ההגברה, הוסף שמונה מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 6 לכל דגימה. טען 15 מיקרוליטר מכל דגימה לתוך ג'ל אגרוז 2%. לאחר מכן, בצע אלקטרופורזה ב-100 וולט למשך 35 דקות במאגר TAE 1X.