אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:09 דק׳ • July 8th, 2025
תגובת שרשרת פולימראז נמס ברזולוציה גבוהה, HRM-PCR, מזהה וריאציות של רצף DNA דו-גדילי, dsDNA בדיוק גבוה.
התחל עם תערובת מאסטר המכילה Taq פולימראז לא פעיל, דאוקסיריבונוקלאוטיד טריפוספטים - dNTPs - וצבע מדווח פלואורסצנטי. הוסף את הפריימרים קדימה ואחורה. פיפטו את התערובת לבארות של צלחת PCR.
הוסף את תבנית dsDNA. אוטמים את הצלחת ומונעים אידוי תערובת. התחל את בדיקת ה-PCR.
טמפרטורת הדנטורה הגבוהה מפרקת את dsDNA ל-DNA חד-גדילי, ssDNA ומפעילה את הפולימראז. לאחר מכן התגובה מקוררת לטמפרטורת החישול, מה שמקל על קשירת פריימר קדימה ואחורה ל-ssDNA באמצעות זיווג בסיסים משלים ספציפי לאתר.
פולימראז מופעל מגוייס, ומרחיב את דופלקס ה-DNA-פריימר על ידי תוספת dNTP.
צבע המדווח הפלואורסצנטי - צבע ספציפי ל-dsDNA הקיים בריכוזי רוויה - משתלב בתוך הדופלקס כולו, זוהר בבהירות. הדופלקס עובר מספר מחזורי PCR, ומייצר מספר שברים המכילים גרסאות.
לאחר PCR, בצע ניתוח עקומת התכה על ידי העלאה מחדש של טמפרטורת התגובה בהתמדה לאורך זמן.
בהתאם לרצף הנוקלאוטידים, האתר המכיל וריאנט עשוי להתפרק תחילה, ולשחרר את הצבע. כאשר אתרי קשירת הצבע הנותרים רוויים, הצבע לא מצליח להשתלב מחדש, מה שמפחית את עוצמת הקרינה. יתר על כן, dsDNA מתפרק ל-ssDNA בחימום מצטבר.
זהה את טמפרטורת ההיתוך, שבה מחצית מה-dsDNA מתפרק ל-ssDNA עם ירידה פלואורסצנטית חד
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים