תגובת שרשרת של Multiplex Droplet Polymerase לזיהוי מתילציה של DNA בלויקוציטים

מתילציה של שאריות ציטוזין DNA היא תכונה אופיינית של לויקוציטים או תאי דם לבנים.

תגובת שרשרת פולימראז מרובת טיפות, או mdPCR, מאפשרת זיהוי בו זמנית של אזורי DNA מרובים שעברו מתילציה בתוך הלויקוציטים.

הכינו תערובת המכילה מאגר תגובה, DNA פולימראז ומים נטולי נוקלאז. הוסף פריימרים קדימה ואחורה ובדיקות הידרוליזה פלואורסצנטיות ספציפיות לכל אזור יעד. הגשושיות מורכבות מדווחי פלואורופור בצבעים שונים הקשורים למרווה כדי לעכב את פליטת הקרינה.

הוסף DNA שהומר על ידי ביסולפיט, שבו הציטוזינים הלא מתיליים מתפרקים לאורצילים בעוד שהציטוזינים שעברו מתילציה נשארים ללא שינוי. לערבב.

מלאו מזרק זכוכית בתערובת פעילי שטח של שמן נשא ואחר בתערובת שמן-PCR נשא, וחברו אותם למחולל הטיפות המיקרופלואידיות. תערובת ה-PCR המימית של הנשא מתחלבת לטיפות בגודל תת-ננו-ליטר. חומר פעילי השטח מייצב את האמולסיה ומונע מיזוג טיפות.

אסוף את הטיפות ובצע PCR. בתוך כל טיפה, טמפרטורת הדנטטורציה הגבוהה מפרקת DNA דו-גדילי ל-DNA חד-גדילי ומפעילה את הפולימראז. טמפרטורת התגובה יורדת, ומאפשרת חישול ספציפי לאתר של הפריימרים והבדיקות.

כאשר הפולימראז קושר ומרחיב את דופלקס ה-DNA-פריימר, אורצילים מתגברים כתימינים, בעוד שציטוזינים שעברו מתילציה מתגברים כציטוזינים, מה שמאפשר הבחנה בין אזורים מתיליים ולא מתיליים. הפולימראז עוד יותר נבקע ומשחרר את המדווח מהגשושית, וגורם לפליטת פלואורסצנטיות.

לאחר PCR, דמיינו את הטיפות תחת מיקרוסקופ. צבע הקרינה מצביע על נוכחות של מטרות DNA מתילציה ספציפיות.

ליצירת טיפות, ערבבו 1 מיקרוליטר של DNA שהומר בביסולפיט עם תערובת מאסטר בדיקה שהוכנה טרי בצינור PCR, ואספו את הדגימה עם צנטריפוגה קצרה. השתמש באביזרי PEEK כדי לחבר צינורות נוזלים חד פעמיים לשני מזרקי זכוכית מדויקים בנפח 250 מיקרוליטר, ומלאו מראש מזרק זכוכית מדויק אחד ב-250 מיקרוליטר שמן נשא המכיל 5% חומר פעילי שטח פלואורו, ומזרק זכוכית מדויק אחד עם 50 מיקרוליטר שמן נשא.

לאחר טעינת שני המזרקים, טען 100 מיקרוליטר מתערובת ה-PCR לתוך מזרק שמן הנשא, והנח מכשיר מיקרופלואידי-טיפתי על הבמה של מיקרוסקופ אור זקוף המצויד במצלמה מהירה.

לתצפית ורישום של היווצרות טיפות בזמן אמת, הנח את המזרקים הממולאים מראש על משאבת מזרק הניתנת לתכנות, והשתמש באיחוד PEEK עם אביזרים כדי לחבר את צינורות המזרקים לצינורות של תעלות הכניסה המתאימות של המכשיר המיקרופלואידי הטיפתי.

הנח את הצינור משקע מחולל הטיפות לחלק הפנימי של צינור PCR בנפח 0.5 מיליליטר, והתאם את קצב זרימת משאבת המזרק ל-2 מיקרוליטר לדקה. אפשר לגודל הטיפה להתייצב לפני איסוף האמולסיה שנוצרה. אסוף לאט ובזהירות את האמולסיה מהחלק העליון של הצינור, והעביר 75 מיקרוליטר מהתמיסה לצינור PCR של 200 מיקרוליטר לרכיבה תרמית.

לאחר מכן, ודא שתכולת השמן בצינור ה-PCR תואמת באופן הדוק את נפח השלב המפוזר כדי למנוע התלכדות של הטיפות במהלך המחזור התרמי, והנח את הצינור בנפח 200 מיקרוליטר לתוך המחזור התרמי.