אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:28 דק׳ • July 8th, 2025
מתילציה של שאריות ציטוזין DNA היא תכונה אופיינית של לויקוציטים או תאי דם לבנים.
תגובת שרשרת פולימראז מרובת טיפות, או mdPCR, מאפשרת זיהוי בו זמנית של אזורי DNA מרובים שעברו מתילציה בתוך הלויקוציטים.
הכינו תערובת המכילה מאגר תגובה, DNA פולימראז ומים נטולי נוקלאז. הוסף פריימרים קדימה ואחורה ובדיקות הידרוליזה פלואורסצנטיות ספציפיות לכל אזור יעד. הגשושיות מורכבות מדווחי פלואורופור בצבעים שונים הקשורים למרווה כדי לעכב את פליטת הקרינה.
הוסף DNA שהומר על ידי ביסולפיט, שבו הציטוזינים הלא מתיליים מתפרקים לאורצילים בעוד שהציטוזינים שעברו מתילציה נשארים ללא שינוי. לערבב.
מלאו מזרק זכוכית בתערובת פעילי שטח של שמן נשא ואחר בתערובת שמן-PCR נשא, וחברו אותם למחולל הטיפות המיקרופלואידיות. תערובת ה-PCR המימית של הנשא מתחלבת לטיפות בגודל תת-ננו-ליטר. חומר פעילי השטח מייצב את האמולסיה ומונע מיזוג טיפות.
אסוף את הטיפות ובצע PCR. בתוך כל טיפה, טמפרטורת הדנטטורציה הגבוהה מפרקת DNA דו-גדילי ל-DNA חד-גדילי ומפעילה את הפולימראז. טמפרטורת התגובה יורדת, ומאפשרת חישול ספציפי לאתר של הפריימרים והבדיקות.
כאשר הפולימראז קושר ומרחיב את דופלקס ה-DNA-פריימר, אורצילים מתגברים כתימינים, בעוד שציטוזינים שעברו מתילציה מתגברים כציטוזינים, מה שמאפשר הבחנה בין אזורים מתיליים ולא מתיליים. הפולימראז עוד יותר נבקע ומשחרר את המ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים