PCR דיגיטלי מבוסס שבב בצינור לכימות גרסאות נוקלאוטידים בודדים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:32 דק׳ • July 8th, 2025
תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית - או dPCR - שימושית לכימות וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים - או SNVs - מוטציה שבה החלפה של נוקלאוטיד בודד במיקום מסוים בגנום יוצרת שתי וריאציות או אללים של נוקלאוטיד.
כדי להתחיל לכמת באמצעות טכניקת dPCR של שבב בצינור, קח דגימת DNA המכילה SNVs - האלל המוטנטי, והאלל המתאים מסוג בר. הוסף תערובת המכילה אנזים DNA פולימראז יציב בחום, dNTPs ופריימרים.
לאחר מכן, הוסף בדיקות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות לאלל - המסומנות עם מדווחים של פלואורסצנטיות בצבעים שונים כדי להבחין בין האללים - ומולקולת מרווה. קרבתו של המרווה לכתב מדכאת את הקרינה שלו.
חלקו את התמיסה לתאי התגובה של שבב מיקרופלואידי. כל תא המכיל אלל משמש ככלי תגובה עצמאי.
הנח את הצינור עם השבב בתוך מחזור תרמי, והתחל את התגובה. בטמפרטורה גבוהה, הדנ"א הדו-גדילי עובר דנטורציה לגדילים בודדים. הורד את הטמפרטורה כדי לחשל את הפריימרים ובדיקות האוליגונוקלאוטידים לאזורים המשלימים שלהם.
בטמפרטורת הארכה מתאימה, ה-DNA פולימראז מאריך את הפריימרים וחותך את הבדיקה. המרחק מהמרווה מאפשר את פליטת הקרינה של הכתב.
קרא את אותות הקרינה בצבעים שונים, וצור תרשים מיקום כדי לזהות את התאים המכילים את האללים.
כדי לקבוע את תדירות האלל המוטנטי - שבר האלל המשתנה - חשב את היחס בין התאים המכילים את המוטנט לעומת האלל מסוג הבר.
הוסף פריימרים, בד
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים