אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 7:50 דק׳ • July 8th, 2025
טכניקת ה-PCR הדיגיטלית מבוססת השבב מחלקת תגובה בודדת לתאים של שבב ננו-פלואידי. ההגברה של הרצפים המחולקים מאפשרת זיהוי של גרסאות תעתיק נדירות - תעתיקים לא קנוניים המתרחשים בתדירות נמוכה.
כדי להתחיל, קח דגימה המכילה cDNA של וריאנט התעתיק הנדיר והגרסה הנפוצה. הוסף תמיסה המכילה DNA פולימראז עמיד בחום, dNTPs ופריימרים.
הוסף בדיקות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות לוריאנט תעתיק נפוצות ונדירות - המסומנות עם מדווחים פלואורסצנטיים שונים ומולקולות מרווה. המרווה סופג את הקרינה של המדווח כאשר הוא נמצא בסמיכות.
טען את התערובת על השבב הננו-פלואידי. התמיסה מחולקת לתאי ננו בגודל אחיד. כל תא המכיל cDNA משמש ככלי תגובה עצמאי.
התחל את תהליך הרכיבה התרמית. טמפרטורת דנטורציה גבוהה מפרידה את הדנ"א הדו-גדילי לגדילים בודדים. הורד את הטמפרטורה, ואפשר לפריימרים ולבדיקות האוליגונוקלאוטידים לחשל לאזורים המשלימים על גדילי ה- DNA הבודדים.
הגדל את הטמפרטורה כדי להגיע לשלב ההארכה, שבו ה-DNA פולימראז מאריך את הפריימר וחותך את הבדיקה. המרחק מהמרווה מאפשר את פליטת הקרינה של הכתב. קרא את אות הקרינה.
צור תרשים פיזור המתאר את התאים עם יעד התעתיק הנדיר המוגבר ואת התאים נטולי המטרה. אותות חיוביים עבור המטרה מצביעים על נוכחות של וריאנט התעתיק הנדיר בדגימה.
כדי להתחיל, תנו למאסטר להתערבב ולבדיקה להפשיר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים