אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma
20 ביוני 2011
Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי מנצל את שרשרת התגובה פולימראז (PCR), אשר הוקמה כשיטת הבחירה של רגישות גבוהה לגילוי של זיהום Mycoplasma, Acholeplasma ו Ureaplasma בתרביות תאים והתרבות תאים אחרים הנגזרים ביולוגיות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים חזותית את השלבים לשימוש בערכת זיהוי מיקופלזמה PCR המותאמת לאיתור זיהום מיקופלזמה. זה מושג על ידי חימום הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס כדי לנטרל כל מולקולות DNA שעלולות להפוך את התבנית הרצויה ללא מתאימה ל-PCR. לאחר מכן, הכינו את הדגימות ל-PCR באמצעות הצינורות המסופקים המקודדים מראש עם נוקלאוטידים, פריימרים ו-DNA בקרה פנימית.
השלב השלישי של ההליך הוא מחזור הטמפרטורה בתנאים המותאמים בקפידה כדי לתת את הרגישות הגדולה ביותר ולמנוע הגברה לא ספציפית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות כדי לקבוע אם הדגימות המדוברות מזוהמות במיקופלזמה באמצעות הערכה על ידי אלקטרופורזה של אגרו ג'ל. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהריאגנטים הם צינורות PCR טרום מימיים ואיכותיים.
זה הופך את זה לנוח ויעיל יותר. יתרון נוסף של ערכה זו הוא שהיא דורשת פחות משני גנומים של מיקופלזמה למיקרוליטר דגימה כדי לזהות זיהום. בעת ביצוע ההליך לזיהוי מיקופלזמה, חשוב להימנע מכל זיהום אפשרי במידת הצורך בציוד מגן אישי מתאים כדי לשמור על חשיפת העור למינימום, לוודא שכל הריאגנטים המשמשים נקיים מזיהום ולשמור על טכניקה אספטית נכונה בכל עת.
ניתן לבצע את ההליך ישירות על סופרנטנטים של תרבית תאים או להכין דגימות לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להכין דגימות לשימוש מאוחר יותר, הניחו 100 מיקרוליטר מכל סופרנטנט בצינור הגברה סטרילי ודגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד שבוע.
רגע לפני בדיקת הדגימות, צנטריפוגה לזמן קצר כדי לגלול כל פסולת סלולרית. כדי להכין דגימות ל-PCR תחילה, קבע את הנפח הכולל של מאגר ההתייבשות של DNA פולימראז הנדרש לתגובות. יש להוסיף יחידה אחת של DNA פולימראז לכל תגובה לנפח המתאים של מאגר ההתייבשות, אשר ישתנה עם ה-tac המשמש בהזנקת הדגמה זו TAC D 93 0 7 ישמש בחמש תגובות, שלוש דגימות בתוספת בקרה חיובית אחת ובקרה שלילית אחת.
הנח את הנפח המחושב של DNA פולימראז לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה נקי ועקוב אחר הנפח המחושב של מאגר ההתייבשות. מערבבים בעדינות את מאגר ההתייבשות של ה-DNA פולימראז על ידי לחיצה על הצינור. אין לערבב את התערובת הזו.
השתמש בצינורות התגובה השקופים המסופקים בערכה כדי להכין את הבקרה השלילית והדגימות. צינורות תגובה אלה כבר מכילים את הנוקלאוטידים, הפריימרים ופיפטת ה-DNA של הבקרה הפנימית 23 מיקרוליטר של מאגר ההתייבשות של ה-DNA פולימראז שהוכן בעבר. מערבבים פנימה כל אחד מצינורות הבקרה השלילית והדגימה.
לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטרים של מים ללא DNA לבקרה השלילית ושני מיקרוליטרים מכל דגימה לצינורות הדגימה המתאימים. מערבבים את התוכן על ידי החלקת הצינורות. התוכן לא צריך להיות מערבולת.
כדי להכין את הבקרה החיובית, השתמש בצינורות התגובה הוורודים המסופקים בערכה. צינורות תגובה אלה כבר מכילים את הנוקלאוטידים, הפריימרים וה-DNA של הבקרה הפנימית ב-25 מיקרוליטר של תערובת חיץ ההתייבשות של DNA פולימראז לצינור התגובה. מערבבים את התוכן על ידי תנועת תוכן הצינור לא צריך להיות מערבולת.
לאחר מכן דגרו את הבקרה החיובית, הבקרה השלילית וצינורות הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את כל צינורות התגובה למחזור תרמי. עבור PCR, הגדר את התנאים הבאים למשך 40 מחזורים.
94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות. אין צורך בשלב הפעלה בעת שימוש ב-Jumpstart tack.
לאחר השלמת מחזורי ה-PCR, הסר את הדגימות מהמחזור התרמי והנח אותן על קרח כדי להתקרר לארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן להעמיס את הדגימות על ג'ל אגרוס לאלקטרופורזה, לטעון ישירות שמונה מיקרוליטר עבור כל תגובת PCR לנתיב נפרד. טעינת. אין צורך להוסיף בופר וצבע לפני טעינת הדגימות מכיוון שהם כלולים בצינורות התגובה.
עצור את האלקטרופורזה לאחר שצבע המעקב נדד 2.5 עד שלושה סנטימטרים. תוצאות מייצגות של זיהוי מיקופלזמה על ידי PCR מוצגות בתמונה זו של נתיב ג'ל ארוס. שתיים היא הבקרה השלילית, שאמורה להראות פס בכ-481 זוגות בסיסים.
היעדר רצועת הבקרה השלילית ב-481 זוגות בסיסים הוא אינדיקטור טוב לכך שה-TAC בו השתמשו לא היה רגיש מספיק. דגימות חיוביות למיקופלזמה יראו רצועות בטווח של 270 פלוס מינוס שמונה זוגות בסיסים כפי שמוצג בנתיבים 3 עד 6. הרצועה תהיה כבדה לדגימות מזוהמות מאוד וחלשה לדגימות מזוהמות קלות.
כל הדגימות מכילות בקרה שלילית פנימית כדי להוכיח שה-PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד. היעדר פס הן בטווח החיובי והן בטווח השלילי כפי שמוצג בנתיב השביעי, הוא אינדיקטור טוב לכך שהדגימות מעוכבות.
אם הדגימה מעוכבת. ניתן להסיר את מעכבי ה-PCR על ידי ביצוע מיצוי DNA. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין היטב כיצד לבצע את כל השלבים הדרושים המתוארים בנוהל הערכה, כמו גם לפרש את התוצאות ולפתור בעיות במידת הצורך.
סקירה כללית
ערכת הגילוי PCR של LookOut Mycoplasma מיועדת לזיהוי רגיש של זיהום מיקופלזמה בתרבויות תאים. הליך זה מדגים את השלבים לשימוש בערכה, כולל הכנת דגימות והגברה ב-PCR.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- תרבות תאים
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- זיהום מיקופלזמה יכול להשפיע משמעותית על תוצאות תרביות התאים.
- שיטת ה-PCR מועדפת על רגישותה הגבוהה בזיהוי מזהמים.
- ערכת ה-LookOut Mycoplasma PCR Detection מפשטת את תהליך הזיהוי.
- טכניקות אספטיות נאותות חיוניות כדי למנוע זיהום במהלך הבדיקה.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש בערכת LookOut Mycoplasma PCR Detection.
- לספק שיטה אמינה לזיהוי זיהום מיקופלזמה.
- לתאר את השלבים להכנת דגימות וביצוע PCR.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- חימום דגימות להשבתה של מולקולות DNA.
- הכנת דגימות עם צינורות בעלי קוד מוקדם המכילים את הריאגנטים הנדרשים.
- ביצוע מחזורי טמפרטורה להגברה ב-PCR.
- הערכת תוצאות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.
תוצאות עיקריות
- דגימות חיוביות למיקופלזמה מראות רצועות מובחנות בתוצאות ה-PCR.
- בקרות שליליות צריכות להציג גודל רצועה ספציפי המצביע על היעדר זיהום.
- היעדר רצועות יכול להעיד על עיכוב בדגימה או על רגישות לא מספקת.
- בקרות פנימיות מאשרות שתהליך ה-PCR היה מוצלח.
מסקנות
- ערכת ה-LookOut Mycoplasma PCR Detection יעילה לזיהוי זיהום.
- טיפול ותפעול נאותים של הדגימות הם חיוניים לתוצאות מדויקות.
- התוצאות יכולות להנחות פעולות נוספות להבטחת שלמות תרבית התאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Mycoplasma contamination poses a significant risk to data integrity in cell-based research, potentially confounding experimental outcomes and wasting resources. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit provides a highly sensitive, rapid method for routine screening, enabling early detection and intervention. This supports predictive confidence in cell line quality and reduces the likelihood of propagating contaminated cultures through discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by ensuring cell line purity, reducing false phenotypes linked to contamination.
- Operational Value: Supports functional target validation through reliable, contamination-free models that maintain consistent proliferation and metabolic profiles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by confirming absence of mycoplasma-induced artifacts in proliferation or signaling assays.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through routine use of a sensitive, standardized detection method with internal controls.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by preventing chromosomal aberrations and metabolic alterations that could skew preclinical efficacy or toxicity readouts.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing a QC checkpoint before transitioning cultures to in vivo studies or IND-enabling work.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early biology to lead identification, serving as a gatekeeping step for culture integrity before compound screening or mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by ensuring observed phenotypes are due to experimental variables, not contamination-induced artifacts.
- Screening: Enables assay readiness through rapid, sensitive detection that allows high-throughput testing of cell line banks with minimal false negatives.
- Analytics: Provides quantitative output via gel electrophoresis band intensity, allowing semi-quantitative assessment of contamination load for troubleshooting.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that toxicology or pharmacology studies use cultures free of mycoplasma-driven variability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable QC platform across departments, supporting centralized cell line management and reducing redundant testing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity from contamination-related phenotypes.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through pre-coded tubes and internal controls, minimizing user error and batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early warning of contamination, preventing investment in flawed datasets.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of cell lines, directing resources toward validated models and reducing late-stage attrition due to biological noise.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise for PCR setup and gel electrophoresis interpretation.
- Needs thermal cycler and agarose gel electrophoresis infrastructure with UV imaging capability.
- Demands strict aseptic technique and segregated pre-/post-PCR areas to prevent amplicon contamination.
- Requires training on internal control interpretation to distinguish true negatives from PCR inhibition.
- Limited to nucleic acid detection; does not assess viability or species identity without follow-up sequencing.
