אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים באופן חזותי את השלבים לשימוש בערכה לגילוי mycoplasma באמצעות PCR, המותאמת לזיהוי זיהום ב-mycoplasma. דבר זה מושג תחילה על ידי חימום הדגימות ל-95 °C כדי להשבית כל מולקולות DNA שעלולות להפוך את התבנית הרצויה לבלתי מתאימה ל-PCR. לאחר מכן, הכין את הדגימות ל-PCR באמצעות המבחנות המסופקות, המקודדות מראש עם נוקלאוטידים, פריימרים ו-DNA של בקרה פנימית.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא מחזורי הטמפרטורה בתנאים שעברו אופטימיזציה קפדנית כדי להשיג את הרגישות הגבוהה ביותר ולמנוע הגברה לא ספציפית. בסופו של דבר, ניתן להוציא תוצאות כדי לקבוע אם הדגימות המדוברות מזוהמות ב-mycoplasma באמצעות הערכה על ידי אגרו-אלקטרופורזה של ג'ל. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהריאגנטים מוכנים מראש ונעשה שימוש במבחנות PCR באיכות גבוהה.

דבר זה הופך את התהליך לנוח ויעיל יותר. יתרון נוסף של ערכה זו הוא שהיא דורשת פחות משני גנומים של mycoplasma למיקרוליטר של דגימה כדי לזהות זיהום. בעת ביצוע ההליך לזיהוי mycoplasma, חשוב להימנע מכל זיהום אפשרי, להשתמש בציוד מגן אישי מתאים כדי לצמצם למינימום את החשיפה של העור, לוודא שכל הרכיבים שבהם נעשה שימוש נקיים מזיהום, ולהקפיד על טכניקה אספטית נאותה בכל עת.

ניתן לבצע את הפרוצדורה ישירות על תעלילים של תרביות תאים, או להכין דגימות לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להכין דגימות לשימוש מאוחר יותר, העבירו 100 µL מכל תעליל למבחנת הגברה סטרילית והדגירו בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. לאחר ההדגרה, ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 2 עד 8 °C למשך עד שבוע.

ממש לפני בדיקת הדגימות, בצעו סבב צנטריפוגה קצר כדי לשקיע שאריות תאיות. להכנת הדגימות עבור PCR, קבעו תחילה את הנפח הכולל של תמיסת ההמסה (rehydration buffer) של DNA polymerase הדרוש לתגובות. יש להוסיף יחידה אחת של DNA polymerase לכל תגובה לנפח המתאים של תמיסת ההמסה, אשר ישתנה בהתאם ל-tac שנעשה בו שימוש בהדגמה זו; jumpstart TAC D 93 0 7 ישמש בחמש תגובות: שלוש דגימות, בתוספת ביקורת חיובית אחת וביקורת שלילית אחת.

העבר את הנפח המחושב של ה-DNA polymerase למבחנה נקייה למיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן הוסף את הנפח המחושב של תמיסת ההרטבה (rehydration buffer). ערבב בעדינות את ה-DNA polymerase ותמיסת ההרטבה על ידי נקישה קלה על המבחנה. אין להשתמש במיקסר (vortex) עבור תערובת זו.

השתמשו בנבובות התגובה השקופות המסופקות בערכה כדי להכין את הביקורת השלילית ואת הדגימות. נבובות תגובה אלו מכילות כבר את הנוקלאוטידים, הפריימרים ו-DNA של ביקורת פנימית; פקטו 23 µL של תמיסת רהידרציה ל-DNA polymerase שהוכנה מראש. ערבבו כל אחת מנבובות הביקורת השלילית והדגימות.

לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של מים נקיים מ-DNA לבקרת השלילה ו-2 µL מכל דגימה למבחנות הדגימה המתאימות. ערבבו את התכנים על ידי נקישה על המבחנות. אין להשתמש במיקסר (vortex) לערבוב התכנים.

להכנת הבקרה החיובית, השתמשו במבחנות התגובה הוורודות המצורפות לערכה. מבחנות תגובה אלו מכילות כבר את הנוקלאוטידים, הפריימרים וה-DNA של הבקרה הפנימית; יש להוסיף למבחנת התגובה 25 microliters של תמיסת רהידרציה עבור DNA polymerase. ערבבו את התוכן באמצעות נקישה קלה על המבחנה; אין להשתמש ב-vortex.

לאחר מכן, דגרו את מבחנות הביקורת החיובית, הביקורת השלילית והדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את כל מבחנות התגובה לטרמיקלר (thermal cycler). עבור ה-PCR, הגדירו את התנאים הבאים ל-40 מחזורים.

94 °C למשך 30 שניות. 55 °C למשך 30 שניות ו-72 °C למשך 40 שניות. שלב הפעלה אינו נדרש כאשר משתמשים ב-Jumpstart tack.

עם השלמת מחזורי ה-PCR, הוציאו את הדגימות מהמעגל התרמי (thermal cycler) והניחו אותן על קרח לקירור לטמפרטורה של ארבע עד שמונה מעלות Celsius. כעת ניתן להעמיס את הדגימות על ג'ל אגרוז לאלקטרופורזה; העמיסו ישירות 8 µL מכל תגובת PCR לנתיב נפרד. אין צורך להוסיף תמיסת טעינה (loading buffer) וצבע לפני העמסת הדגימות, כיוון שהם כלולים בשפורי התגובה.

עצרו את האלקטרופורזה לאחר שצבע המעקב נדדה 2.5 עד שלושה סנטימטרים. תוצאות מייצגות של זיהוי mycoplasma באמצעות PCR מוצגות בתמונה זו של נתיב בג'ל אגרוז. נתיב מספר שתיים הוא הבקרה השלילית, שבה אמור להופיע פס באורך של כ-481 base pairs.

היעדרו של פס השלילה ב-481 זוג בסיסים מהווה אינדיקציה טובה לכך ש-TAC שנעשה בו שימוש לא היה רגיש מספיק. דגימות חיוביות ל-Mycoplasma יראו פסים בטווח של 270 פלוס או מינוס שמונה זוג בסיסים, כפי שמוצג בנתיבים שלושה עד שישה. הפס יהיה עבה בדגימות מזוהמות מאוד ודהה בדגימות מזוהמות קל.

כל הדגימות מכילות בקרת שלילה פנימית כדי להוכיח כי ה-PCR התרחש כמצופה. היעדר הבקרה הפנימית בדגימות מזוהמות מאוד הוא תופעה נורמלית. היעדר פס הן בטווח החיובי והן בטווח השלילי, כפי שמוצג במסלול שבעה, מהווה אינדיקציה טובה לכך שהדגימות מעוכבות.

במידה והדגימה מעוכבת, ניתן להסיר מעכבי PCR על ידי ביצוע מיצוי DNA. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע כל השלבים הדרושים המתוארים בנוהל הערכה, כמו גם כיצד לפרש את התוצאות ולבצע פתרון בעיות בעת הצורך.