בידוד מקרופאגים מגנגליון שורש גבי עכברי באמצעות דיסוציאציה מכנית

גנגליון השורש הגבי (DRG) הוא מקבץ של גופי תאים עצביים לאורך חוט השדרה הנושאים מידע חושי ממערכת העצבים ההיקפית למערכת העצבים המרכזית. פגיעה עצבית היקפית גורמת להצטברות מקרופאגים ב-DRG ולהתפתחות כאב נוירופתי.

כדי לבודד מקרופאגים ברי קיימא בשיטה נטולת אנזימים, קח רקמת DRG של עכבר שזה עתה נותחה בהומוגנייזר מלא במאגר קר כקרח כדי להגביל את הלחץ התאי. בעזרת עלי, הומוגניזציה מכנית של הרקמה כדי לשחרר את התאים.

סנן דרך מסננת תאים כדי להסיר גושי תאים ולקבל תרחיף חד-תאי בזרימה. הרקמה ההומוגנטית מכילה נוירונים ותאים לא עצביים, הכוללים מקרופאגים ומיאלין צף חופשי - המעטפת המבודדת של נוירונים.

הוסף את ההומוגנאט המסונן לתוך צינור המכיל מדיום שיפוע צפיפות, וצנטריפוגה. תחת כוח צנטריפוגלי, התאים ברי קיימא עם צפיפות ציפה גבוהה יותר מתיישבים בתחתית הצינור ליצירת כדור, בעוד המיאלין נשאר תלוי. השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במאגר המכיל נוגדנים מצומדים פלואורופור כנגד קולטנים ספציפיים למקרופאגים. דגירה למשך הזמן הנדרש. הנוגדן נקשר לקולטן שלו על תאי המקרופאגים, ובכך מסמן באופן פלואורסצנטי את פני התא. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה. אות פלואורסצנטי ספציפי לנוגדנים מצביע על נוכחות של מקרופאגים בדגימה.

לפני תחילת הניסוי, הכינו את תמיסת העבודה של מדיום שיפוע הצ