בידוד מקרופאגים מגנגליון שורש גבי עכברי באמצעות דיסוציאציה מכנית

גנגליון השורש הגבי (DRG) הוא מקבץ של גופי תאים עצביים לאורך חוט השדרה הנושאים מידע חושי ממערכת העצבים ההיקפית למערכת העצבים המרכזית. פגיעה עצבית היקפית גורמת להצטברות מקרופאגים ב-DRG ולהתפתחות כאב נוירופתי.

כדי לבודד מקרופאגים ברי קיימא בשיטה נטולת אנזימים, קח רקמת DRG של עכבר שזה עתה נותחה בהומוגנייזר מלא במאגר קר כקרח כדי להגביל את הלחץ התאי. בעזרת עלי, הומוגניזציה מכנית של הרקמה כדי לשחרר את התאים.

סנן דרך מסננת תאים כדי להסיר גושי תאים ולקבל תרחיף חד-תאי בזרימה. הרקמה ההומוגנטית מכילה נוירונים ותאים לא עצביים, הכוללים מקרופאגים ומיאלין צף חופשי - המעטפת המבודדת של נוירונים.

הוסף את ההומוגנאט המסונן לתוך צינור המכיל מדיום שיפוע צפיפות, וצנטריפוגה. תחת כוח צנטריפוגלי, התאים ברי קיימא עם צפיפות ציפה גבוהה יותר מתיישבים בתחתית הצינור ליצירת כדור, בעוד המיאלין נשאר תלוי. השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במאגר המכיל נוגדנים מצומדים פלואורופור כנגד קולטנים ספציפיים למקרופאגים. דגירה למשך הזמן הנדרש. הנוגדן נקשר לקולטן שלו על תאי המקרופאגים, ובכך מסמן באופן פלואורסצנטי את פני התא. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה. אות פלואורסצנטי ספציפי לנוגדנים מצביע על נוכחות של מקרופאגים בדגימה.

לפני תחילת הניסוי, הכינו את תמיסת העבודה של מדיום שיפוע הצפיפות על ידי ערבוב תשעה נפחים של המדיום עם נפח אחד של סידן ומגנזיום 10X HBSS, ושמרו אותו על קרח. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין מחוסר התגובה לצביטה בכף האחורית.

התחל בהנחת עכבר מורדם בתוך מכסה אדים כימי במצב שכיבה עם ארבע כפות מאובטחות בסרט. השתמש במלקחיים כדי להרים את העור מתחת לכלוב הצלעות, ולאחר מכן בעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך קטן כדי לחשוף את הכבד והסרעפת. בעזרת אותם מספריים, חותכים את הסרעפת ואת כלוב הצלעות, ואז פותחים את חלל הצדר כדי לחשוף את הלב הפועם.

לאחר מכן, בעזרת מספריים לקשתית, חתוך במהירות את התוספתן הפרוזדורי הימני. לאחר זיהוי הדימום, הכנס מחט בגודל 30 לקצה האחורי של החדר השמאלי, והזריק לאט 10 מיליליטר של 1X PBS מקורר מראש כדי לחלחל את החיה.

כדי לבצע כריתת למינקטומיה גבית, הנח את העכבר במצב שכיבה. השתמש באזמל בגודל 11 כדי לבצע שני חתכים אורכיים רוחביים עמוקים החל מאזור בית החזה ועד לאזור העצה. לאחר מכן, הסר את העור החושף את שכבת שריר הגב. לאחר מכן, בעזרת פרידמן-פירסון רונגר, מקלפים את רקמות החיבור והשרירים עד לחשיפת תהליכי עמוד השדרה המותני ותהליכים רוחביים דו-צדדיים.

ראשית, השתמש ברונגר פרידמן-פירסון כדי לפתוח בזהירות את עמוד השדרה הגבי. לאחר מכן, החלף בין מספריים של פרידמן-פירסון רונגר למספריים של נויס ספרינג כדי להסיר את עצמות החוליות, ולחשוף את חוט השדרה עם עצבי עמוד שדרה שלמים מחוברים. נתח בזהירות DRG מותני מקביל ונגד.

הכניסו אותו ל-1 מיליליטר של סידן קר כקרח ו-1X HBSS ללא מגנזיום בהומוגנייזר רקמות של Dounce. הומוגניזציה של רקמת ה-DRG בהומוגנייזר Dounce עם עלי רופף במשך 20 עד 25 פעמים. הניחו מסננת תאי ניילון סטרילית בגודל 70 מיקרומטר בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. השתמש ב-800 מיקרוליטר של 1X HBSS קר כקרח כדי להרטיב את מסננת התאים.

השתמש בפיפטה כדי לאסוף את תרחיף הרקמה ההומוגני מההומוגנייזר על מסננת התאים הרטובה, ואסוף אותו לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר. שוטפים את ההומוגנייזר פעמיים עם 800 מיקרוליטר 1X HBSS קר כקרח, ואוספים את הנוזל לאותו צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי להגדיל את התשואה.

הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות איזוטונית מאוזנת כקרח לתוך צינור FACS פוליסטירן סטרילי של 5 מיליליטר. העבירו את התא הומוגנאט מהצינור החרוטי של 50 מיליליטר לתוך צינור ה-FACS הזה, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.

הוסף עוד 500 מיקרוליטר של 1X HBSS כדי לאטום את החלק העליון. צנטריפוגה של התאים ב 800 פעמים גרם למשך 20 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנטנט המכיל מיאלין בתווך, מבלי להפריע לכדורית התא בתחתית הצינור.

הוסף לגלולה 100 מיקרוליטר של PBS המכיל 5% סרום בקר עוברי, והשהה מחדש את תאי ה-DRG. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן CX3CR1-APC של עכבר אלפא לתאים ודגרו בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.

שוטפים את התאים פעם אחת עם 5 מיליליטר PBS. צנטריפוגה של התאים ב -360 פעמים גרם למשך 8 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט, ולאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא ב-300 מיקרוליטר של PBS לניתוח FACS.