Name: מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למדו לבצע מבחני התחדשות ב-Dugesia japonica באמצעות שיטות תרופתיות וגנטיות. השיטה כוללת חיתוך, טיפול בתרופות ו-RNAi להבנת ביולוגיה התחדשותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה במעבדה נתמך על ידי ה-NSF (MCB0919933) ו-NIH (GM088790).

1. שבר Trunk התחדשות assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק להאכיל קבוצה של תולעים לפחות 5 ימים לפני assay משובי כדי להבטיח חיים חופשיים של פסולת מזון מעובדים (~ 30 תולעים תמים, כל תולעת ~ 8-10 מ"מ אורך הפוסט רעב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, לשטוף צלחת מראש קפוא קרח מפולס עם מים מכסים את פני השטח קר שטוח בניילון נצמד. בעזרת מלקחיים, במקום אחד נייר לסנן על עטיפת הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את נייר הסינון עם כמה טיפות של מי המעיין. העברת planarians על מסנן (&lt;20 תולעים לכל פילטר) באמצעות פיפטה ההעברה. תולעים ניתן למקמו מחדש על המסנן, במידת הצורך, על ידי repipetting עם מי מעיינות יותר. הסר את הנוזלים העודפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לכרות את ראשו על ידי חתך אחד עשה בערך באמצע הדרך בין הקודקוד הקדמי של החיה, ואת הקצה הקדמי של הלוע (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לכרות באזור הזנב על ידי חתך אחד עשה בערך באמצע הדרך בין קצה הזנב של החיה ולסיים האחורי של הלוע (איור 1A). הסר ליחה על האזמל באמצעות מגבת נייר טבולה אתנול 70% לאחר חיתוך. נגב אתנול עודף אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה דרך מסנן מלקחיים לתוך צלחת פטרי (100 x 25mm עומק) המכיל מים באביב. חכו ~ 3 דקות (לסגירת הפצע, נצפים על ידי צובט ו המחשיך של הפצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שברי המטען מנייר מסנן לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני הרצוי עבור assay העברת משובי כדי thermostatted בחממה (24 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון פנוטיפ משובי אחרי שבוע ~ 1, כאשר המבנים מחדש ניתנים לזיהוי (איור 1A). </li></ol> 2. מניפולציה תרופתי של התחדשות: bipolarity המושרה על ידי praziquantel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן praziquantel (PZQ) מניות על ידי תרופה solubilizing ב DMSO (62.4mg PZQ ב 1mL עבור המניות 200 מ"מ). השתמש ב באותו יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 50 מ"ל של תמיסת תרופות המכילות (90 מיקרומטר PZQ) ב מלחים Montjuch שנאגרו. וורטקס דקה 1 ~ כדי להבטיח פיזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע קטע המטען assay משובי כמפורט לעיל [פרוטוקול מס '1], חושפת קבוצה של שברי המטען כדי PZQ בשלב האחרון [1.7]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24-48 שעות, חילופי PZQ המכילים המדיה עבור מי המעיין, כביסה כמה תולעים (&gt; 3) פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור תולעים חממה. Bipolarity ציון (שני ראשים, איור 1B) שבוע לאחר חיתוך. </li></ol> 3. מניפולציה גנטית של התחדשות: בפרוטוקול האכלה RNAi vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני assay, להכין כבד עוף homogenate. בטל שומן, חלקים בצבע צהוב foodstock, והכבד פירה הנותרים. סנן פירה דרך מסננת רשת ההשעיה aliquot לאחסון (1.5mL צינורות, -20 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני assay, להכין שור בתאי הדם האדומים (RBCs) על ידי אספקת aliquoting לתוך דגימות 1mL, המאוחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תולעים עבור RNAi. שלוש קבוצות משמשים: הגן של עניין, בקרה חיובית (גן עם פנוטיפ RNAi ידועים; תרשים 1C, D &amp; E) בקרה שלילית (גן עם פנוטיפ לא RNAi, שימושי גם עבור הערכה של רמות מציאה לעומת המחזור ניסיוני). עבור כל קבוצה, השתמש ~ 250 תולעים (~ 80-10 מ"מ זמן רב לאחר רעב במשך לפחות 5 ימים). חנות במי מעיינות בגיגית פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל המניות, להפשיר RNAi עוקבה של E. coli להביע dsRNA גן מיקוד של עניין [8], יחד עם שפופרת של homogenate כבד עוף [3.1] ו שפופרת של RBCs [3.2]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חיידקים (13,000 גרם, 1 דקה). הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 2xYT התקשורת (~ 700μl). Recentrifuge, להשליך supernatant, מקום גלולה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור גדול נשא P200 קצה פיפטה ידי ניתוק סוף של קצה. ביסודיות resuspend גלולה חיידקים בתערובת של כבד עוף homogenate (150 μL) ו RBCs (50 μL) כדי ליצור תערובת RNAi האכלה. הסר בועות אוויר על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור האכלה, להסיר את רוב המים מהאמבטיה פלסטיק המכיל תולעים (להשאיר ~ עומק 1 אינץ'). אמבט מערבולת להתרכז תולעים במרכזו של מיכל זה, פיפטה לערבב RNAi האכלה במעגל corralling תולעים. השתמש פיפטה להעביר בזהירות לשדל הנמלטים חזרה אל תערובת האכלה RNAi ללא מביך הסועדים האחרים! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האכלה (~ 1 שעה), לזהות planarians שהזינו היטב. תולעים אלו מראים גוון אדום עמוק מן RBCs ingested. בטל אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחליף האכלה פתרון עם מי מעיין טריים, מזעור ההפרעה למנוע egestion של מזון. כדי לעשות זאת, בעדינות למקם את התולעים לצד אחד של הצינור בעזרת פיפטה העברה, לשפוך מים עכורים, ובזהירות להחליף עם מים מתוקים זרמו במורד קיר מול האמבט. Planarians Resubmerge במהירות חשיפה ממושכת באוויר גם התוצאות egestion מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Loosely seאל מכסה מיכל ולחזור בחממה (24 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול RNAi האכלה במשך מחזורים רבים (~ 2-3 ימים בנפרד), וביניהם מחזורי משובי [פרוטוקול מס '1] למסך של פנוטיפים RNAi. פרוטוקול סטנדרטי עבור הזנה והתחדשות יעיל גנים רבים מוצג באיור 2, אשר לוקח ~ 1 חודש משך מוחלט. </li></ol> שינוי זה תוכנית עבור גנים שונים, כפרוטוקול האופטימלי יהיה תלוי בגורמים כמו יציבות mRNA, לוקליזציה רקמות, perdurance חלבון, או פיתוח של פנוטיפ אשר מונע מחזורים האכלה מרובים לאחר התחדשות. הערכת רמות מציאה פשוט על ידי סינון penetrance של הפנוטיפ (אם לכאורה), או על ידי גישות qPCR להשוות את רמות ה-mRNA ממוקד עם עוקבה בקרה שלילית. 4. נציג תוצאות: שבר המטען assay התחדשות הוא חזק כל כך תולעים צריך להתחדש עם ("ראש אל זנב") קדמי, אחורי נורמלי קוטביות. זה יכול להיות הבקיע בהקדם חמישה ימים לאחר חיתוך, בהנחייתם של הופעתה של eyespots קדמית (asterixed, איור 1 א). עם זאת, שיקום של מבנים מורפולוגיים להשלים איבד מתרחשת לאחר שבוע אחד. מניפולציה תרופתי של התחדשות שבר המטען על ידי PZQ להניב שני ראשים תולעים (איור 1B) גם חזקים (EC 50 = 87 (+ -) שברי דו קוטבית 11%, 70μM PZQ למשך 48 שעות 20). Bipolarity מתרחשת על פני מחזור משובי יחיד. יעילות נמוכה של מבחני אלה סביר מתייחס בעיות מסיסות התרופה ו / או אחסון או שימוש מין התולעת השטוחה שונים שבהם PZQ אינו יעיל. עבור תרופות עם penetrance נמוך, מדד anteriorization משמש לעתים קרובות כדי להבקיע פנוטיפים ביניים מלבד 22 bipolarity להשלים. פנוטיפים הנובע RNAi של מבנים בקרה חיובית מוצגים איור 1: RNAi של Dugesia japonica שש 1 (ד j ושש-1) תוצאות פנוטיפ חסר עיניים 23 (תרשים 1C), RNAi של Dugesia PC2 japonica (Dj-PC2) התוצאה היא הפסד של התגובה סלידה אור 24 (איור 1D) ו RNAi של Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) תוצאות פנוטיפ שני ראשים 16-19, 21 מתוך רסיסי המטען (איור 1E). פנוטיפים אלו יכולה להיות מושגת באמצעות הבאה פשוט RNAi פרוטוקולים: Dj ושש-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), כאשר F = מחזור האכלה x = מחזור משובי בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="איור 1"> איור 1:... שבר Trunk התחדשות assay שמאל, תמונה של planarian (למעלה) ו סכמטית (באמצע) כדי להראות מיקום המטען נכרת שבר ימינה, timecourse של התחדשות שבר המטען מראה מראה שבר התחדשות בזמנים המצוין (ימים) B תמונה של planarian שני ראשים המיוצר על ידי חשיפה PZQ. C תולעת "פרצוף ללא עיניים" המיוצר על ידי Dj ושש-1 RNAi. הפסד D התגובה סלידה אור תנועה Dj-PC2 RNAi תולעים (אדום מוכתם), לעומת תולעת לשלוט ניידים (מוכתם ירוק). E דו קוטבית planarian המיוצר על ידי Dj-βcatenin-1 RNAi. ב BE, סוף הקדמי המקורי של תולעים RNAi מכוונת שמאלה. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="איור 2"> איור 2: רצף של האכלה חיתוך מחזורים בפרוטוקול RNAi טיפוסי הכולל ארוחות מרובות (F), מחזורי רגנרטיבית (x) כי הוא יעיל עבור מציאה של גנים רבים ד japonica. שינוי של פרוטוקול זה גנים בודדים עשוי להיות נחוץ כדי להניב תוצאות אופטימליות, למשל באמצעות פחות (בסוגריים) או מספר גדול יותר של האכלה מחזורי ההתחדשות.

<ol><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Entwm+Org%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+patterns+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li>
<li>Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li>
<li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li>
<li>Newmark, P. A. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+needed+for+regeneration%2C+stem+cell+function%2C+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li>
<li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li>
<li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+the+central+nervous+system%3A+how+easy+for+planarians%21%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li>
<li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li>
<li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22A+Laboratory+Manual+Chapter%22%5BJournal%5D)">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li>
<li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians%3A+translations+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li>
<li>Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li>
<li>Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li>
<li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Hedgehog%2FPatched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li>
<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li>
<li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li>
<li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2%2B+channel+beta+subunits%3A+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li>
<li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li>
<li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li>
<li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Djeyes+absent+%28Djeya%29+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li>
<li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+%28CNS%29+revealed+by+neuronal+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקולים המתוארת כאן מבחני פרט ללימוד וטיפול התחדשות של Dugesia planarian japonica. הם פשוט אינם דורשים ציוד מיוחד כגון שהם יכולים להתבצע בקלות במעבדה או בכיתה. מבחני יכול להתבצע בנפרד, או בשילוב (להקרנה כימיים הגנטי של efficacies התרופה in vivo) והוא יכול להתבצע ברמת גן מועמד, או להתאמה ההקרנה, משוחדת תפוקה גבוהה יותר 8. בין אם עבור מחקר על הביולוגיה של planarians מסקרן בזכות עצמם, או להערכת תפקוד vivo של homologues יונקים במודל חלופי ללימוד התחדשות רקמות, הגישות הללו יש אינטרס לזרז מתוך מגוון רחב של החוקרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> מוכר </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מים חיים </td><td> Kandiyohi. Premium ווטרס בע&quot;מ Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> צורות אחרות של מי מעיינות לעבוד היטב גם. לראשונה מבחני הכדאיות משפט. </td></tr><tr><td> 1 x שנאגרו מלחי Montjuïch: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0.1mm), KCl (0.1mm), NaHCO3 (1.2 מ&quot;מ), HEPES (1.5mm). pH 7.4 בשעה 24 ° C. </td><td> מספר ספקים </td><td> n / a </td><td> מים מלאכותית עבור טיפולים תרופתיים במהלך מבחני משובי כדי להבטיח חציצה pH. פתרון 5 / 8 של Holtfreter מהווה חלופה. </td></tr><tr><td> 2xYT מרק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP2467-500 </td><td> מדיה = 31 גר &#39;/ ליטר. Autoclaved. </td></tr><tr><td> צלחת פטרי (100x25mm) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-757-11 </td><td> שיכון תולעים במהלך מחזורי התחדשות </td></tr><tr><td> כיכר מהודרת (100x100x15mm) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-757-11A </td><td> ממלאים במים, להקפיא עבור מגש קרח משמש משטח חיתוך תולעת </td></tr><tr><td> גיגית פלסטיק: n טוויסט סגירה &quot;לוק (16oz). </td><td> קמעונאים שונים </td><td> n / a </td><td> מיכלי מים נוח חזק עבור קבוצות RNAi </td></tr><tr><td> כבד עוף </td><td> מסחרי מכולת </td><td> n / a </td><td> הטיה כלפי אספקה ​​אורגני, עקב הימנעות של אנטיביוטיקה. </td></tr><tr><td> בלנדר יד </td><td> כל ספק למטבח </td><td> n / a </td><td> השתמש להכנת פירה כבד עוף </td></tr><tr><td> 1mm Wire Mesh מסננת </td><td> כל ספק למטבח </td><td> n / a </td><td> השתמש עבור מאמץ כבד עוף ופירה </td></tr><tr><td> שור דם תאים אדומים </td><td> Lampire מעבדות ביולוגיות </td><td> 7240807 </td><td> 100% שטף ונקווה ההשעיה RBC </td></tr><tr><td> ניירות לסנן חוזר </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> העברת פיפטה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי, להבים כירורגי </td><td> מספר ספקים </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4668 </td><td> חנות aliquots אבקת בחושך ב 4 ° C. ליבש. </td></tr><tr><td> Dj ושש-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> RNAi בקרה חיובית פנוטיפ &quot;עין פחות&quot; 23 </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> RNAi בקרה חיובית פנוטיפ שני ראשים 17 </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> RNAi בקרה חיובית עבור אובדן פנוטיפ סלידה אור 24 </td></tr></tbody></table>

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של planarian japonica dugesia</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

חופשי חיים תולעים שטוחות planarian יש היסטוריה ארוכה של שימוש ניסיוני בשל היכולות משובי מדהים שלהם 1. שברים קטנים נכרת מבעלי חיים אלה את תוכנית הרפורמה הגוף המקורי בעקבות התחדשות של מבנים בגוף חסר. לדוגמה, אם שבר &quot;המטען&quot; נחתך מן התולעת בשלמותה, &quot;ראש&quot; חדש יתחדשו anteriorly ו &#39;זנב&#39; יתחדשו בדיעבד שחזור המקורי הקוטביות &quot;ראש אל זנב&quot; של מבנים בגוף לפני קטיעה (איור 1A). התחדשות הוא מונע על ידי בתאי גזע planarian, המכונה &quot;neoblasts&quot; אשר להתמיין ~ 30 סוגי תאים שונים במהלך הומאוסטזיס הגוף נורמלי התחדשות רקמות נאכף. תהליך ההתחדשות הוא חזק וקל להוכיח. בשל חנוכת המעבדות חלוצי מספר כלים רבים ושיטות גנטית תפקודית יש עכשיו מערכת אופטימיזציה עבור מודל זה. כתוצאה מכך, התקדמות האחרונות ניכרת נעשתה בהבנה לתמרן את האירועים המולקולריים שבבסיס פלסטיות התפתחותית planarian 2-9. מערכת מודל planarian יהיה לעניין מגוון רחב של מדענים. עבור מדעני מוח, המודל מאפשר את ההזדמנות ללמוד את התחדשות של מערכת העצבים כולה, ולא רק לצמיחה מחודשת / תיקון של תהליך תא עצב יחיד, כי בדרך כלל הם מוקד המחקר במודלים הוקמה רבים. Planarians להביע שפע של נוירוטרנסמיטרים 10, מייצגים מערכת חשוב לחקר האבולוציה של מערכת העצבים המרכזית, 11, 12 יש פוטנציאל ההקרנה התנהגות 13, 14. תוצאות משובי ניתנים למניפולציה על ידי apparoaches תרופתי ו גנטית. לדוגמה, תרופות יכול להיות מוקרן על ההשפעות על התחדשות פשוט על ידי הנחת שברי גוף סמים המכילים פתרונות בנקודות זמן שונות לאחר קטיעה. תפקידה של גנים בודדים ניתן ללמוד בשיטות מציאה (in vivo RNAi), אשר יכולה להיות מושגת גם דרך מחזורי microinjection או האכלה bacterially, הביע בונה dsRNA 8, 9, 15. שתי הגישות יכול לייצר פנוטיפים מרשים ויזואלית על התחדשות גבוהה penetrance-עבור, למשל של חיות דו קוטבית 16-21. כדי להקל על אימוץ של מודל זה ויישום של שיטות כאלה, אנחנו ראווה מאמר זה פרוטוקולים וידאו עבור מבחני תרופתי וגנטיים (in vivo RNAi על ידי האכלה) באמצעות Dugesia planarian japonica.

מודל אטרקטיבי עבור הלומדים תא גזע בידול בתוך החי הוא התולעת השטוחה planarian. התחדשות הוא למד על ידי ניסויים פשוטים קטיעה מבוצעים בקלות במעבדה בסיסי הנוחות (תרופתי ו גנטית<em&gt; In vivo</em&gt; RNAi) מניפולציה כמפורט על ידי פרוטוקולי במאמר זה.

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

לתולעי פלאנריה (planarian flatworms) חופשיות יש היסטוריה ארוכה של שימוש ניסיוני, הודות ליכולות ההתחדשות המדהימות שלהן1. מקטעים קטנים שנכרתו מ...

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לבצע ולשלוט במבחני התחדשות בתולעי שטח מסוג Parian, תוך שימוש בשיטות פרמקולוגיות ו/או שיטות של השתקה גנטית (knockdown). השלב הראשון הוא לשלוט במבחן הבסיסי של קטיעה והתחדשות. לאחר מכן מוצג כיצד ניתן להשתמש בתרופות כדי להפוך את הפולריות של ההתחדשות, לדוגמה, כדי להניב בעלי חיים עם שני ראשים.לבסוף, ניתן תיאור של אופן ביצוע RNAi in vivo באמצעות האכלה, במטרה לבחון את ההשפעות של אובדן תפקוד של גנים ספציפיים. התוצאות מראות כי טיפול בתרופה quintal משבש את הרגנרציה ומביא להיווצרות תולעים בעלות שני ראשים, וכי knockdown גנטי של betaine ו-isoform מביא לפנוטיפ דומה באופן גס.שלום, שמי ג'ון צ'אן, סטודנט לתואר מתקדם במעבדת marching, ואני אדגים את הפרוצדורות הללו. הדגמה ויזואלית של שיטות אלו חשובה כיוון שעל אף ששום שלב בודד אינו קשה כשלעצמו, הדגמה כוללת של טכניקות אלו תסייע לחוקרים החדשים במערכת מודל זו.כהכנה לבדיקה, הפסיקו להאכיל קבוצה של כ-30 תולעי parian למשך חמישה ימים לפחות לאחר הרעבה. אורך התולע ביום הבדיקה צריך להיות בין 8 ל-10 מילימטרים. שטפו במים צלחת קרח מפולסת מראש וכסו את פני השטח השטוחים והקרים בניילון נצמד בעזרת פינצטה.הניחו דף סינון אחד על ניילון נצמד. הרטיבו את דף הסינון באמצעות מספר טיפות של מי מעיין בעזרת פיפט העברה; הניחו לא יותר מ-20 plin על המסנן. במידת הצורך, ניתן למקם מחדש את התולעים על המסנן על ידי שאיבה מחדש עם מי מעיין נוספים.לאחר שהתולעים ממוקמות, הסירו נוזלים עודפים באמצעות סקלפל, וסמנו את הראש על ידי ביצוע חתך יחיד בערך במחצית הדרך בין הקצה הקדמי של בעל החיים לבין הקצה הקדמי של הבלעום. לאחר מכן, הסִירו את אזור הזנב על ידי ביצוע חתך יחיד בערך במחצית הדרך בין קצה הזנב של בעל החיים לבין הקצה האחורי של הבלעום. הסירו ריר עודף מהסקלפל באמצעות נייר סופג שהורטב ב-70% ethanol לאחר החיתוך, ולאחר מכן נגבו את ה-ethanol העודף מהסקלפל לפני החיתוך הבא.הרימו את המסנן באמצעות פינצטה והעבירו אותו לצלוחית פטרי המכילה מי קפיץ. המתינו כသုံး דקות לסגירת הפצע, הניתנת לצפייה על ידי התכווצות וההשחרה של הפצע. שטפו את חלקי הגזע מהנייר המסנן אל תוך צלוחית פטרי המכילה את המצע הרצוי לבדיקת הרגנרציה, והעבירו למדגרה תרמוסטטית המכוון ל-24 °C.בצעו דירוג של הפנוטיפ הרגנרטיבי לאחר כשבוע. כאשר ניתן לזהות מבנים שחודשו, הכינו תמיסת אם של 200 millimolar של quintal או PZ Q על ידי המסה של התרופה ב-DMSO לשימוש טרי באותו היום. לאחר מכן, הכינו 50 milliliters של תמיסה המכילה את התרופה על ידי הוספת 22.5 microliters של תמיסת ה-PZ Q למלחים מנופצים של majic buffered (buffered majic salts) וערבבו ב-vortex למשך כדקה אחת.כדי להבטיח פיזור, הניחו את התולעים על נייר סינון שהורטב במי מעיינות ובצעו קטיעה של אזור הראש ואזור הזנב כפי שמתואר במבחן רגנרציה של פרגמנטציה של הגוף. לאחר הקטיעה וסגירת הפצע, העבירו את פרגמנטי הגוף לתוך צלחת פטרי עם מי מעיינות. החליפו את המצע לפתרון PZ Q בריכוז 90 micromolar והעבירו את צלחת הפטרי לאינקובטור בטמפרטורה של 24 degrees Celsius. לאחר 24 עד 48 שעות, החליפו את המצע המכיל PZ Q במי מעיינות, שטפו את התולעים מספר פעמים, החזירו את התולעים לאינקובטור ולאחר שבוע, דרגו את הפנוטיפ הביפולרי או את התופעה של ראשים כפולים של התולעים לפני המבחן.הכינו הומוגנאט של כבד עוף; השליכו את החלקים השומניים בצבע צהוב מהמלאי של חומרי הגלם, וטחנו את שאר הכבד. סננו את התערובת הטחונה דרך מסננת רשת והכינו תרחיף עבור אחסון. לאחר מכן, הכינו תאי דם אדומים של בקר (RBCs) על ידי חלוקת האספקה לדגימות של 1 mL המאוחסנות בטמפרטורה של 20°C-.השתמשו בתולעים שהורגבישו למשך חמישה ימים וחלקו אותן לשלוש קבוצות: ביקורת חיובית של הגן המחקרי (גן עם פנוטיפ RNAi ידוע) וביקורת שלילית (גן ללא פנוטיפ RNAi).עבור כל קוהורט, השתמש בכ-250 תולעים באורך של שמונה עד 10 מילימטרים. הפשר מלאי של e coli עבור כל קוהורט המבטא RNA דו-גדילי, המכוון לגנים הרלוונטיים, יחד עם מבחנה של הומוגנאט כבד של עוף ומבחנה של RBCs. שקע את החיידקים על ידי סנטריפוגציה ב-13,000 Gs למשך דקה אחת, הסר את העלייה (supernatant) ותלה את המשקע ב-700 µL של מצע 2X YT.סבב נוסף של צנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון ולאחר מכן הניחו את המשקע על קרח. צרו טיפ פ pipette P 200 בעל פתח רחב על ידי חיתוך הקצה; השביחו היטב את המשקע הבקטריאלי ב-150 µL של הומוגנאט כבד עוף בתוספת 50 µL של RBCs כדי ליצור תערובת האכלה ל-RNAi. הסירו בועות אוויר באמצעות פעימה קצרה של צנטריפוגה לפני ההאכלה.הסיר את רוב המים מהגיגית הפלסטית המכילה את התולעים, כך שיישאר עומק של כאינץ' אחד. סובב את הגיגית כדי לרכז את התולעים במרכז המכל. לאחר מכן, טפטף באמצעות פיפטה תערובת האכלה ל-RNAI במעגל, כדי לכסוף את התולעים.השתמשו בפיפטת העברה כדי להחזיר בזהירות תולעים שברחו חזרה אל תערובת ההאכלה של ה-RNAi, מבלי להפריע לשאר האוכלים. לאחר האכלה של כשעה אחת, זהו את הפרטים שניזונות היטב והסיר כל תולעת שנראית כמי שלא ניזונה מספיק. תולעים שניזונות היטב יציגו גוון אדום עמוק כתוצאה מבליעת RBCs.החליפו בזהירות את תמיסת ההזנה במים מינרליים טריים, תוך הקפדה על מזעור ההפרעות כדי למנוע בליעה של מזון. לשם כך, רכזו בעדינות את התולעים לצד אחד של האמבט באמצעות צינור העברה. שפכו את המים המלוכלכים והחליפו אותם בזהירות במים טריים שיישפכו על הדופן הנגדית של האמבט, תוך השקעה מהירה של הפרטים כדי למנוע חשיפה ממושכת לאוויר.מוביל גם לצריכה רפויה של מזון. אטמו את מכסה המכל והחזירו את התולעים למדגרה בטמפרטורה של 24 degrees Celsius. חזרו על פרוטוקול ההאכלה של RNAi זה לאורך מספר מחזורים המופרדים ממחזורי התחדשות כדי לסרוק בסופו של דבר פנוטיפים של RNAi.כאן מוצג לוח זמנים סטנדרטי להזנה ולרגנרציה היעיל עבור גנים רבים. F מייצג את פרוטוקול ההזנה ו-X מייצג את בדיקת הרגנרציה. בסך הכל, הפרוטוקול נמשך כחודש אחד וניתן להתאימו לגנים שונים על ידי הכללה של פחות סבבי הזנה, המסומנים בסוגריים (F), או יותר סבבים, שכן הפרוטוקול האופטימלי תלוי בגורמים כגון יציבות ה-mRNA, מיקום רקמתי, חלבון, P dur, או התפתחות של פנוטיפ המונע סבבי הזנה מרובים לאחר רגנרציה.להלן תוצאות טיפוסיות של בדיקת התחדשות הגו. משמאל, מוצג פרט מסוג parian מעל סכימה המציינת את חיתוכי הקטיעה. מימין מוצג מהלך זמן של התחדשות מקטע גו המתרחשת לאורך שבעה ימים, כאשר נקודות עיניות מופיעות עד היום השלישי.כאן מוצגת החתרגנות פרמקולוגית של התחדשות מקטעי גו עם PZ Q. טיפול הניב תולעים בעלות שני ראשים באמצעות RNAi נגד הגן DJ 61. בפרוטוקול הזנה של FX FX התוצאה היא פנוטיפ ilis, אובדן של תגובת סמיות לאור הנצפית לאחר פרוטוקול הזנה של FFFX; תולעי RNAi של DJ PC שני אינן ניידות וצבועות באדום בהשוואה לקבוצת ביקורת ניידת. תולע צבועה בירוק לאחר השתקת RNAi של DJ beta catine באחת.שימוש בפרוטוקול הזנה מסוג FXFX מוביל לה regeneration של ראש מפצע אחורי. לאחר ביצוע נהלים אלה, חוקרים יוכלו להתמקד בגנים הרלוונטיים למחקרם באמצעות שיטות knockdown או סוכנים פרמקולוגיים סלקטיביים, במטרה לבחון את תפקידם בביולוגיה של parian ובהתחדשות רקמות.

pharmacological-functional-genetic-assays-to-manipulate-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

השיטה יעילה השתלת רקמות בגודל מוגדרת ועקבית בין planaria מתואר. היא כללה גם תיאור של איך להשתמש בטכניקה immobilization להשתלה ניתן להתאים, בשיתוף עם מגן עופרת, הקרנה חלקית של בעלי חיים.

Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

גישות לבדיקת ההשפעות של תרופות אנטיפסיכוטיות (APDs) בelegans Caenorhabditis הם הפגינו. מבחני מתוארים לבדיקת השפעות תרופה בפיתוח וכדאיות ועל קצב שאיבת בלוע. שיטות אלה חלות גם על ניסויי pharmacogenetic עם כיתות סמים אחרות מאשר APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלית, ואת הבסיס העצבי של התנהגות האור המושרה.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

Planarian Schmidtea התיכון ונמצא היא דוגמנית מעולה ללימוד בתאי גזע והתחדשות רקמות. פרסום זה מתאר שיטה להסרת איבר אחד, הלוע, באופן סלקטיבי על ידי חשיפת לבעלי חיים אזיד הנתרן כימי. פרוטוקול זה גם מתאר שיטות לניטור הלוע התחדשות.

כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

תנועתיות פלנרית משמשת כדי לאמוד את תכונות ממריצים ונסיגה של מוצרים טבעיים בהשוואה לתנועה של בעלי החיים במעיין בלבד.

תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים

תכנון מים מתוקים מציגים שלוש חבטות (גלישה, פריסלזיס, ו כיווץ) הניתנים להבחנה על ידי ניתוח התנהגותי כמותי. אנו מתארים שיטה לגרום לכיסה באמצעות גירויים מזיקים שונים, כימות שלהם, והבחנה בין פריסלזיס וגלישה. באמצעות נוק-דאון גנטי, אנו מדגימים את הספנות של התכתשות כקריאה פנוטיפית כמותית.

התכתוב תכנון כקריאה התנהגותית כמותית עבור חישת גירויים מזיקים

פרוטוקול זה מציג צעדים שננקטו לניתוח השחלות בפלנריות המים המתוקים, Schmidtea mediterranea. השחלות המנותחות תואמות לניתוח חיסוני נוגדנים וניתוח אולטרה-סטרוקטורלי עם מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת כדי לחקור את הביולוגיה התאית של הביציות והתאים הסומטיים, ומספקות עומק ואיכות הדמיה שלא היו נגישים בעבר.

דיסקציה פלנרית של השחלה לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי וצביעת נוגדנים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

למדו לבצע מבחני התחדשות ב-Dugesia japonica באמצעות שיטות תרופתיות וגנטיות. השיטה כוללת חיתוך, טיפול בתרופות ו-RNAi להבנת ביולוגיה התחדשותית.

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia

גלה סרטונים נוספים