הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשחזר באופן ביוכימי קומפלקס של חלבון HSB 90 וקולטן סטרואידי, ולהפעיל מחדש את פעילות קישור הליגנד של הקולטן הסטרואידי, דבר שניתן להשתמש בו כדי לבחון את דרישות הקו-פקטור של HSB 90 ואת ההשפעות של הוספת תרכובות אקסוגניות לתהליך השחזור. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ציטוזול תאי המכיל קולטני גלוקוקורטיקואיד תפקודיים. לאחר מכן, GR מתוך הציטוזול התאי עובר אימונו-ספיחה וספיחה אנדוגנית.

HSP 90 מופרד. לאחר מכן, קומפלקס ההטרו-GR HSP 90 מורכב מחדש באמצעות מקור חיצוני של HSP 90 וחלבוני ליווי (chaperone proteins) וקו-פקטורים אחרים. לבסוף, קומפלקסי החלבון שהורכבו מחדש ופעילות קישור הליגנד נבדקים; באופן ספציפי, נעשה שימוש בשיטות כגון SDS page, western blotting ובדיקות קישור ליגנד רדיואקטיבי כדי להדגים את היווצרות קומפלקס ההטרו-GR HSP 90 ואת פעילות קישור הסטרואידים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המלווה המולקולרי HSP 90, כגון אילו מלווה-קו-פקטורים (cofactor chaperones) ומלווה-COS נדרשים כדי להקל על הפעילות התפקודית של HSP 90. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קיפול חלבונים, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון פיתוח תרכובות מובילות (lead compounds) התלויות ב-HSP 90 וניתוח מסלולי אותיות תוך-תאיים הדורשים HSP 90. את הפרוצדורה ידגימו האנה פרנקלין ונאתן פור-אווה, שני סטודנטים שסיימו לאחרונה את לימודיהם במעבדתי. כדי לבודד קולטן גלוקוקורטיקואיד תפקודי או GR, גדלו תאי פיברובלאסט עכברי L 9 29 או תאי SF nine שהודבקו בנגיף בוואו (baculovirus) רקומביננטי של GR ונמצאים בשלב הצמיחה האקספוננציאלית. סבבו את תלי השכבה של התאים ב-5,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

המשקע המתקבל צריך להיות בנפח של כ-1 עד 5 milliliters. שטפו את משקע התאים שלוש פעמים עם 15 milliliters של תמיסת Hank's buffered saline. הכינו 1.5 נפחים של חוצץ הומוגניזציה המכיל HEM buffer, 1 millimolar phenyl methyl syl fluoride או PMSF ושלוש טבליות mini protease inhibitor מלאות שנטחנו באמצעות 50 תנועות של מטחנת downs.

ההומוגניזר פיקח את התאים; יש לבצע את השלב על קרח כדי למנוע דגרדציה של חלבונים. יש לבצע אולטרה-צנטריפוגציה להומוגנאט ב-100,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. יש לחלק את העלייה (supernatant) המכילה את הציטוזול למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 ml, בנפחים של 500 µL כל אחת, ולאחסן בטמפרטורה של 20°C-.

כדי להכין תערובת המכילה נוגדן IgG מונוקלונלי שהופק נגד הרצפטור הספציפי GR, ערבבו 100 microliters של ציטוזול מפקיק GR שהופשר, 200 microliters של בופר TEGM, 100 microliters של תרחיף protein A-sepharose או PAS בריכוז 20%, וחמישה micrograms של נוגדן IgG מונוקלונלי anti-G, כגון bugger two. זאת בשל הגודל הגדול יחסית של חרוזי ה-PAS.

השתמשו בטיפ קטוע של פיפט P 200 כדי להעביר PAS מהסלרי (slurry) בריכוז 20% למבחנות דגימה. הניחו את הדגימות על גלגל סיבוב אנכי והדגירו למשך שעתיים לפחות בסיבוב קבוע. לאחר מכן, הסירו את החלבונים שאינם קשורים ממשקע ה-PAS של הנוגדן על ידי סבוב של הדגימות בצנטריפוגה מקוררת למשך דקה אחת.

ב-10,000 Gs, שטפו את המשקע פעמיים על ידי הוספת מיליליטר אחד של בופר TEGM, ערבוב ב-vortex, ולאחר מכן ספינטר. הסירו את השטיפה האחרונה באמצעות טיפ של פיפט P 200 עם קrimp כדי להפריד HSB 90 אנדוגני ממשקע ה-GR אימונו, והוסיפו 355 מיקרוליטר של בופר TEG ו-45 מיקרוליטר של נתרן כלורי בריכוז five molar לנוגדן. משקע PAS שהוכן מראש.

הניחו את הדגימות על גלגל סיבוב אנכי והדגירו למשך שעה וחצי בסיבוב קבוע. הסירו את החלבונים שאינם קשורים מהמשקע החסוני (immuno pellet) על ידי סרגימר למשך דקה אחת ב-10,000 Gs. שטפו את המשקעים פעם אחת עם 1 mL של תמיסת TEG ופעם אחת עם 1 mL של תמיסת HEPES בריכוז 10 mM ב-pH 7.4. בעזרת טיפ פפיטה P 200 מכווץ, הסירו את תמיסת השטיפה, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע.

כדי לשחזר את הקומפלקס ההטרוגני GR HSB 90, הוסף למשקע תערובת המכילה 50 microliters של מקור למלווה מולקולרי (molecular chaperone), כגון ליזאט של רטיקולוציטים של ארנב, וחמישה microliters של מערכת לייצור ATP. השלב הבא הוא קריטי כדי להבטיח ערבוב נאות של המשקע ותמיסת השחזור. דגור את הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 30 degree Celsius למשך 20 דקות בדיוק.

יש לנער קלות את המבחנות בכל דקה עד שתי דקות כדי להפריע בעדינות למשקע ולערבב את תמיסת השחזור. יש להוסיף 1 mL של באפר TEGM, לבצע ערבול בוורטקס וסבוב בצנטריפוגה ב-10,000 Gs למשך דקה אחת. יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות כדי לא לפגוע במשקע.

חזור על השטיפה פעמיים נוספות כדי לזהות חלבונים במשקע השוחזר. הכן דגימות לאלקטרופורזה על ידי הוספת 50 µL של תמיסת דגימה עבור SDS page המכילה betta mercaptoethanol v. ערבב את הדגימות ולאחר מכן הדגס אותן למשך חמש דקות באמבט מים רותחים או בבלוק חימום אלקטרוני בטמפרטורה של 100 °C.

סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-10,000 Gs למשך דקה אחת. השתמשו בנוזל העלון (supernatant) מדגימות אלו עבור SDS page או אלקטרופורזה מיקרופלואידית ולאחריה western blot. שימוש בטיפ מקרימפ (crimped tip) של P 200 לטעינת הנוזל העלון יגביל שאיבה מקרית של המשקע.

השלב הבא הוא לבחון את פעילות קישור הסטרואידים של קומפלקס החלבון GR HSP 90. באמצעות סטרואיד מסומן בטריטיום, התחל בהוספה למשקע האימונו-רקומביננטי: 47.5 µL של HEM buffer ו-2.5 µL של dexamethasone מסומן בטריטיום בריכוז 2 µM.

ערבבו בעדינות את המשקע, תוך הקפדה לצמצם את כמות הדגימה שנדחפת לדופן מבחנת המיקרו-צנטריפוגה. הדגירו את הדגימה למשך לילה על קרח ללא הפרעה. הוסיפו 1 mL של בופר TEGM, ערבבו בעדינות וסבבו בצנטריפוגה ב-10,000 GS למשך דקה אחת.

שפכו את העליון בזהירות. הוא מכיל סטרואידים טריטיומיים שאינם קשורים. חזרו על הפעולה עבור סך של שלושה שטיפות מלאות עם באפר TEGM. הסירו את כל העליון בסיום השטיפה האחרונה.

באמצעות טיפ של פיפט P 200 עם קליפס. השעו את משקעי האימונו-פלטס השטופים ב-200 microliters של באפר TEGM והעבירו לבקבוקי סינטיליציה של 10 milliliters.

הוסיפו 4.8 milliliters של תמיסת סינטילציה (scintillation cocktail) למבחנות וערבבו ב-vortex. לבסוף, בצעו ספקטרומטריית סינטילציה נזילה; נתוני SDS page ו-western blot מייצגים מוצגים כאן בג'ל שצבע ב-kumasi stain. קומפלקס ה-hetero האנדוגני של GR HSB 90 נספח חיסונית (immuno absorbed) מציטוזול התא באמצעות נוגדנים ל-GR, והחלבונים הבודדים שנספחו יחד עם ה-GR מוצגים בתמונה.

להלן נתוני אלקטרופורזה מיקרופלואידית המייצגים קומפלקסים הטרוגניים משוחזרים של GR ו-HSP 90. הספציפיות של האימונו-אדסורבציה של GR מאושרת על ידי החלפת הנוגדן האנטי-GR המשמש לאדסורבציה בנוגדן לא-חיסוני, גם כאשר נעשה שימוש בכמויות מופרזות. לא שוקעו GR או צ'פרונים מולקולריים באופן אימונו-פרסיפיטציה.

באופן דומה, ניתן לאשר את הדיסוציאציה של HSP 90 וחלבוני שפרונית (chaperone) אחרים מה-GR שנוקה ממלחים באמצעות Western blot של ה-immuno pellets לאחר הניקוי וההרכבה מחדש. השרשרת הכבדה של הנוגדן המשמש לספיחה אימונית ניתנת לגילוי הן על ידי צביעת Coomassie והן על ידי Western blotting, והיא מאשרת כי בכל נתיב מוצגים immuno pellets בגודל שווה. נתוני פעילות קישור סטרואידים מייצגים של ה-GR שנספח אימונית מוצגים כאן תוך שימוש בליזט רטיקולוציטים או בחלבונים מנוקים.

פעילות קישור הסטרואידים של קומפלקס ההטרו-GR HSB 90 המשוחזר חוזרת בדרך כלל לרמה של 75 עד 100% מרמת פעילות הקישור של ה-GR HSB 90 האנדוגני. בדומה לנתוני האלקטרופורזה, ניתן להשתמש בנוגדן לא-חיסוני במקום בנוגדן anti GR כביקורת שלילית וכמדד לקישור סטרואידים טריטיומיים שאינו ספציפי. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי (2D gel electrophoresis) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של HSP 90 על שחזור קומפלקס ההטרו ועל קישור סטרואידים. בדיקות שחזור, כגון אלו המתוארות כאן, אפשרו לחוקרים לבחון את המשמעות התפקודית של מנגנון השפרונים MultiPro המבוסס על HSP 90 HSP 70 ואת הרכבתו השלבית, תוך שימוש ברצפטור הגלוקוקורטיקואיד כחלבון לקוח מודלי של HSP 90.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת קומפלקסים תפקודיים של חלבון HSP 90 וקולטן גלוקוקורטיקואיד מחלבונים מנוקים בליזאטים תאיים. השלבים כוללים הכנת ליזאט תאי המכיל GR, ספיחה חיסונית של הקולטן, הסרת חלבונים אנדוגניים באמצעות שטיפה במלח (salt stripping) ושחזור של ההטרו-קומפלקס באמצעות HSP 90 אקסוגני, קו-פקטורים של HSP 70 וקו-שפרונים.