הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לבחור עמודת כרומטוגרפיה נוזלית אופטימלית מסוג HI באמצעות שיטת סריקה (scouting) אוטומטית לטיהור של חלבון רקומביננטי, תוך שימוש במערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ בינוני מסוג BioRad DUO flow. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת הבאפרים הנדרשים וליזאטים בקטריאליים המכילים את החלבון הרקומביננטי המבוקש. לאחר מכן, מערכת הכרומטוגרפיה duo flow מותקנת פיזית, מחוברת לצנרת ומוכנה לפרוטוקול הסריקה.

לאחר מכן טוענים את הדגימות ומפעילים את שיטת סקירת עמודי ה-HI המתוכננת כדי לאסוף את דגימות ה-fraction eit. לבסוף, מנתחים את ה-EIT ומזהים את עמוד ה-HI והמדיה האופטימליים על בסיס מאפייני ההפרדה שנצפו. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המצביעות על מדיום עמוד HI מועדף לטיהור בקנה מידה מוגדל של החלבון הנחקר באמצעות כרומטוגרפיה של נוזלים בלחץ בינוני, תוך שימוש ביכולות סקירת עמודי ה-HI האוטומטיות של DUO flow.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הרצות רצופות של כרומטוגרפיה על עמודה באופן ידני, הוא שהאוטומציה של התהליך מפחיתה את השונות ומבטיחה תוצאות הניתנות לשחזור גבוה. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להיתקל בקשיים בשל המורכבות הפיזית של מערכות כרומטוגרפיה נוזלית מודרניות. עם זאת, ניתן לשלוט בשיטה זו בקלות.

לאחר תרגול מספיק, את הפרוצדורה ידגימו Orange Stone ו-Shelly Anderson, שני סטודנטים מהמעבדה שלי. לתחילת העבודה, הכינו 500 milliliters מהבופרים הבאים: 200 millimolar sodium phosphate עבור בופר A1, 200 millimolar sodium hydrogen phosphate עבור בופר A2, ו-4.8 molar ammonium sulfate עבור בופר B2; מים דאיוניים ישמשו כבופר B1. בצעו ניקוי גזים (degas) מהבופרים כדי להבטיח תנאי הפעלה כרומטוגרפיים אופטימליים. מערכת ה-maximizer תערבב את בופרים A1 ו-A2 כדי להפיק בופר אלוציה פוספטי בעל ריכוז מלח נמוך, ותערבב את בופרים B1 ו-B2 כדי להפיק תמיסת ammonium sulfate בריכוז מלח גבוה.

בפר בהתחלה. הכינו 20 מיליליטר של דגימה להעמסה על ידי ערבוב של 10 מיליליטר של ליזא תאים המכיל את החלבון לטיהור עם 10 מיליליטר של באפר B two. ריכוז האמוניום סולפט הסופי של תמיסת דגימת ליזא התאים צריך להיות בערך 2.4 molar, מה שהופך אותה לשקולה בקירוב לבפר ההתחלתי.

סננו את תערובת באפר הליזאט דרך מסנן מזרק של 0.45 micrometer עם קישוריות נמוכה לחלבונים כדי להסיר חלקיקים מהתמיסה. השאירו את הדגימה על קרח עד להעמסתה במערכת. ההגדרה הפיזית והצנרת של מערכת הכרומטוגרפיה הן מההיבטים המורכבים ביותר של פרוצדורה זו.

הקימו את מערכת כרומטוגרפיית הזרימה הכפולה (duo flow chromatography) בהתאם לדיאגרמה המוצגת כאן. ודאו כי קיימים נפחים מספיקים של בופר עבור הפרוטוקול כולו וכי הצינורות יישארו טבולים. חברו את שסתום טעינת הדגימה ואת לולאת הדגימה הדינמית כפי שמוצג כאן, וחברו את לולאת הדגימה לכניסת שסתום הדגימה בעמדה שלוש.

הכינו שמונה זוגות זהים של צינורות peak בעובי חיצוני של 1/16 אינץ'. לאחר מכן, חברו את הזוגות לעמדות אחת עד שמונה של שני שסתומי בחירת העמודות. לאחר הדלקת נורות גלאי ה-UV ואישור שכל הגלאים כוילו, חברו את שסתום מפצל הזרם של אספן הפראקציות ואת בקר המפצל כפי שמוצג כאן.

שסתום הפיצול של אספן הפראקציות בעמדה שתיים ובקר הפיצול מופעלים באופן נפרד מתחנת העבודה של הכרומטוגרפיה. הגדירו את אחוז הפיצול ל-10. החליפו את ראש הטפטוף הסטנדרטי של אספן הפראקציות בעמדה שתיים בראש טפטוף עבור מיקרופלטה.

שטפו את לולאת הדגימה (sample loop) ונקו את מערכת הכרומטוגרפיה. לאחר מכן, התחילו זרימה ידנית של באפר פיתוח (evolution buffer) דרך המערכת בקצב של 1 mL/min. חברו עמודי trap HI של 1 mL לעמדות שתיים עד שמונה של שסתומי בחירת העמודים.

הסר את המחבר (union) המקשר בין שסתומי הבחירה של עמודות המיקום שתיים. חבר את מחברי העמודה שמעלה (upstream) ל-duo flow. העבר את בופר האלוציה דרך המחברים עד שכל האוויר יסולק ותיווצר טיפה גדולה של בופר.

בשלב הבא, הסירו את הפקק המחובר לכניסת העמודה והניחו טיפה גדולה של בופר בעל ריכוז מלח נמוך בחלקו העליון של העמודה. לאחר מכן, חברו את העמודה למחברי המעלה (upstream). חברו את היציאה למחברי העמודה במורד הזרם (downstream) ולצינורית שסתומי הבחירה.

הגדירו את הגבלת לחץ הנגב (back pressure) ל-40 PS.I. שטפו את העמודה בחמישה נפחי עמודה של באפר אלוציה (Evolution buffer) בקצב זרימה של 1 mL לדקה. שטפו את העמודה ב-10 נפחי עמודה של באפר התחלה (start buffer) בקצב זרימה של 1 mL לדקה.

לאחר שהתרשמויות ה-pH וה-UV והלחץ האחורי התייצבו, העבר ידנית את שסתומי בחירת העמודה למצב אחד והפסק את זרימת הבאפר. כדי להטעין דגימה, טבול את צינור כניסת הדגימה בתוך 20 milliliter של הדגימה. לאחר מכן, העבר את שסתום טעינת השטיפה של לולאת הדגימה למצב אחד ואת שסתום טעינת הדגימה למצב purge.

הפעילו את משאבת טעינת לולאת הדגימה, כך שתישאב דגימה אל תוך צינורית המשאבה בקצב זרימה של 1 mL לדקה, עד לרגע הגעת הדגימה לשסתום טעינת הדגימה. העבירו את שסתום טעינת הדגימה ממצב ניקוי (purge) למצב טעינה (load). הפעילו מחדש את משאבת טעינת לולאת הדגימה בקצב זרימה של 1 mL לדקה, עד שתישאבו 10 mL של דגימה אל תוך לולאת הדגימה הדינמית, דרך חלון ההגדרות בתוכנת ה-biologic.

בחר את התקני המערכת המסומנים בכוכבית בטבלה זו. לאחר מכן, בחר שש עמודות HIC להרצת תוכנית בדיקה. גרדיאנט מלח יורד ליניארי ושיטת סקירה של שש עמודות יתחילו ידנית את זרימת תמיסת הבאפר ההתחלתית בקצב של 1 mL/min.

לחצו על start בבקר המפחית (splitter controller) כדי להתחיל את פיצול הזרם ב-EIT ביחס של 90% ל-10%. מיד לאחר הפעלת שיטת התוכנית, לחצו על start בלוח הבקרה שעל המסך של אספן הפרקציות (fraction collector) במצב offline עבור פלטת 96 בארות. עקבו אחר התצוגה בזמן אמת כדי לאשר את פרמטרי ההרצה הצפויים. השוו את עקומת הבליעה ב-397 nanometer הספציפית ל-GFP לעקומת הבליעה הכללית של חלבונים ב-280 nanometer כדי להעריך את ההפרדה והטיהור היחסיים תוך שימוש במדי ה-HI השונים הנבדקים. ניתן להעביר מנות (aliquots) של 5 עד 50 µL מהפרקציות שפלטת 96 הבארות לפלטה חדשה ולבצע בדיקה לתכולת חלבון ספציפית באמצעות ELISA או Western blot, ולתכולת חלבון כוללת באמצעות SDS page או מערכת electrophoresis מיקרופלואידית של Experian. מוליכות מפל ה-hick salt ולחץ עמודה מייצגים מהרצות הבדיקה מוצגים כאן.

השינוי בריכוז המלח, כפי שנמדד על ידי אחוז התמיסה שנשאבה מקווי תמיסת מלח בריכוז גבוה, הוא אופייני למתודולוגיית HI. ככל שריכוז המלח יורד, חלבונים הקשורים לעמודה נשטפים (elute); המוליכות, המתאימה לריכוז המלח הנצפה, נמדדת בקו מיד לאחר גלאי ה-quad tech וה-UV. ההיסט (offset) בין מעקב גרדיאנט המלח למעקב המוליכות מעיד על הזמן הדרוש לתמיסה כדי לנוע מכניסת התמיסה, דרך המערכת, ועד לניטור המוליכות.

במהלך הרצת הדגימה, לחץ המערכת וה-pH נותרים קבועים יחסית. איור זה מציג כרומטוגרמות של הרצות סקר רצופות בעמודת HI עם גילוי מקוון של חלבון כולל. NGFP מבוצע על ידי מדידת בליעת אור ב-280 nanometers וב-397 nanometers, בהתאמה.

ניתן להעריך את השפע היחסי של GFP ואת ההפרדה עבור כל ריצת סקירה. על ידי השוואת שני הקווים באיור זה, מבחנות תרבית עבור פראקציות 10, 12, 14, 16 ו-18 של ריצת הסקירה של fennel FF נצפו תחת תאורת חדר רגילה או פלורסצנטית ותחת נורות אור על-סגול (UV), כאשר הצפייה בוצעה הן מהחזית והן מלמעלה כדי להבחין בספקטרום הפליטה האופייני של GFP; ניתן לזהות GFP באופן ברור בפראקציה 14. בשני תמונות ה-UV, הצבע הכחול המפוזר בפאנל ה-UV השמאלי הוא אור הנפלט ממנורת ה-UV.

נתונים אלו, שנמדדו לאחר ההרצה, תואמים היטב לגילוי ה-GFP בזמן אמת באמצעות מדידת בליעה של האלואט באורך גל של 397 nanometers, אשר גם היא מזהה את פרקציה 14 כמכילה את השיא העיקרי של ה-GFP שאלואט. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון western blotting, Eliza's, מיקרוסקופיית כוח אטומי ובדיקות רקונוסטיטציה ביוכימיות כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לטוהר ולפעילות התפקודית של החלבון המטוהר.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את הצורך בשליטה ידנית במערכת הזרימה הכפולה במספר נקודות בשיטה. דוגמאות לכך כוללות מילוי מחדש של באפר, טעינת דגימות, בדיקה לאיתור בועות אוויר, והדלקה או כיבוי של נורות הגילוי לפי הצורך. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן השימוש במערכת כרומטוגרפיה נוזלית לביצוע סקר אוטומטי עבור עמודי HI ומדיה אופטימליים.

הניתוח המעריך של ה-inline וה-poster יאפשר לחוקר לבחור עמודה מתאימה לטיהור בהגדלת קנה מידה (scale up) בהמשך, אשר ניתן לשלב גם עם שיטות כרומטוגרפיות אחרות כדי להגביר את טוהר חלבון המטרה ואת התנובה.