בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

מיקרוגליה - המקרופאגים השוכנים במוח - מבטאים CD11b, אינטגרין על פני התא.

כדי לבודד מיקרוגליה ממוחות גורי עכברים, קח שברי מוח בצינורות דיסוציאציה המכילים חיץ עם פפאין, אנזים פרוטאוליטי ודאוקסיריבונוקלאז.

הניחו את הצינורות על מפריד מכני. במהלך הריצה, המפריד משבש מכנית את הרקמה.

פפאין מעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, ומשחרר תאים, כולל מיקרוגליה, לתרחיף. דאוקסיריבונוקלאז משפיל DNA חופשי בתרחיף, ומונע בידוד תאים לא יעיל.

צנטריפוגה. השלם את הניתוק המכני על ידי פיפטינג. העבירו את התרחיף דרך מסננת תאים כדי להסיר פסולת וגושי תאים, ולקבל אוכלוסייה הומוגנית של תאים בודדים.

דגירה עם מיקרו-חרוזים סופר-פרמגנטיים המתפקדים עם נוגדנים נגד CD11b. המיקרו-חרוזים נקשרים באופן ספציפי ל-CD11b בתאים, כולל מיקרוגליה.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט המכיל חרוזים לא כרוכים. השעו מחדש את התאים במאגר. טען על עמוד המונח על מפריד מגנטי. העמוד מורכב ממטריצה עם חרוזים פרומגנטיים.

כאשר הם מונחים על המפריד, הכדורים בתוך העמודה מגבירים את השדה המגנטי, ושומרים על תאי CD11b+ הקשורים למיקרו-חרוזים בתוך העמודה, בעוד שתאים אחרים זורמים דרכו.

הסר מהמפריד והשתמש במאגר כדי להוציא את תאי CD11b+ מהעמודה. צנטריפוגה את התרחיף והשעיה מחדש של תאי CD11b+ בתווך מיקרוגליה.

התאים המבודדים מוכנים לניתוח נוסף.

הכן תערובת דיסוציאציה על פי טבלה זו. העבירו 12 חתיכות מוח לתוך צינור C במשקל כולל של 1.2 גרם לכל צינור דיסוציאציה. לאחר מכן, הנח צינורות C על המפריד עם חימום. הפעל את תוכנית NTDK האופטימלית בניתוק. צנטריפוגה למשך 20 שניות. השלם את הדיסוציאציה המכנית על ידי פיפטינג שלוש פעמים.

העבירו את התאים לארבעה צינורות של 15 מיליליטר עם מסננות מחוברות. שוטפים את המסננות עם 10 מיליליטר HBSS עם סידן ומגנזיום. צנטריפוגה למשך 10 דקות, והסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר. בזהירות, הוסיפו 10 מיליליטר HBSS עם סידן ומגנזיום, והשעו מחדש את הגלולה. שוב, צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה עם 6 מיליליטר של מאגר מיון. חזור על הצנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת מיקרו-חרוז CD11b, ודגרו על הצינורות למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השעו מחדש את הגלולה עם 6 מיליליטר של מאגר מיון. חזור על הצנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה עם 8 מיליליטר של מאגר מיון.

לאחר מכן, עקוב אחר תוכנית POSSEL במפריד כדי להכין שמונה עמודות. העבירו את התאים דרך העמודה על ידי הוספת 1 מיליליטר של תרחיף תאים בכל פעם. עם 1 מיליליטר של מאגר מיון, יש להוציא תאים חיוביים CD11b על צלחת פליטה סטרילית. אסוף את התאים בצינור של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה והשעיה מחדש של הגלולה עם 10 מיליליטר של מדיום מיקרוגליה קר. ספור את התאים החיוביים CD11b. השעו מחדש את התאים במדיום מיקרוגליה קר כדי לקבל ריכוז סופי של 650,000 עד 700,000 תאים למיליליטר.