זיהוי מעכבי קינאז המווסתים את תגובת התימוציט לאותות TCR חזקים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 6:42 דק׳ • July 8th, 2025
התחל עם תאי תימוציט עכברים בצלחת מרובת בארות. הוסף חרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ואנטי CD28. לתת-קבוצה של בארות, הוסף ריכוז מתאים של מעכב קינאז הבדיקה. דגירה.
הנוגדנים נקשרים לקולטני CD3 ו-CD28 על פני התא על התימוציטים החיוביים הכפולים ומפעילים אותם, מה שגורם לוויסות נמוך של קולטני תאי T, TCRs והפעלה של חלבון קינאז ציטוזולי.
קינאזות חלבון אלה מפעילות מסלולי איתות במורד הזרם, מה שמוביל לביטוי מוגבר של CD69 על פני התא ולהפעלת קספאז-3 ציטוזולי. קספאז-3 מופעל מבקע חלבונים תאיים חיוניים - ויוזם אפופטוזיס של תימוציטים.
בתאים המטופלים במעכב קינאז, המעכבים חוסמים את הקינאזות הציטוזוליות, מווסתים את ביטוי CD69 והפעלת קספאז-3.
פיפטה בקוקטייל נוגדנים מתויג פלואורופור שנקשר לקולטני TCR, CD4 ו-CD8 של התימוציטים, וקולטני CD69. טפל בתימוציטים עם חיץ כדי לתקן ולחדור אותם.
דגירה עם נוגדן אנטי-קספאז-3 מתויג פלואורופור הנקשר לקספאז-3 ציטוזולי. נתח את התימוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה.
תימוציטים חיוביים כפולים מבטאים את סמני פני התא הפלואורסצנטיים CD4, CD8 ו-CD69 ואת הקספאז-3 התוך-תאי ומראים ויסות נמוך של TCR. לעומת זאת, תימוציטים שטופלו במעכבים מציגים רמות נמוכות יותר של CD69 פלואורסצנטי וקספאז-3.
כדי להתחיל בטיפול בתימוציטים עם מעכבי קינאז, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 40 מיקרוליטר
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים