זיהוי מעכבי קינאז המווסתים את תגובת התימוציט לאותות TCR חזקים

התחל עם תאי תימוציט עכברים בצלחת מרובת בארות. הוסף חרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ואנטי CD28. לתת-קבוצה של בארות, הוסף ריכוז מתאים של מעכב קינאז הבדיקה. דגירה.

הנוגדנים נקשרים לקולטני CD3 ו-CD28 על פני התא על התימוציטים החיוביים הכפולים ומפעילים אותם, מה שגורם לוויסות נמוך של קולטני תאי T, TCRs והפעלה של חלבון קינאז ציטוזולי.

קינאזות חלבון אלה מפעילות מסלולי איתות במורד הזרם, מה שמוביל לביטוי מוגבר של CD69 על פני התא ולהפעלת קספאז-3 ציטוזולי. קספאז-3 מופעל מבקע חלבונים תאיים חיוניים - ויוזם אפופטוזיס של תימוציטים.

בתאים המטופלים במעכב קינאז, המעכבים חוסמים את הקינאזות הציטוזוליות, מווסתים את ביטוי CD69 והפעלת קספאז-3.

פיפטה בקוקטייל נוגדנים מתויג פלואורופור שנקשר לקולטני TCR, CD4 ו-CD8 של התימוציטים, וקולטני CD69. טפל בתימוציטים עם חיץ כדי לתקן ולחדור אותם.

דגירה עם נוגדן אנטי-קספאז-3 מתויג פלואורופור הנקשר לקספאז-3 ציטוזולי. נתח את התימוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה.

תימוציטים חיוביים כפולים מבטאים את סמני פני התא הפלואורסצנטיים CD4, CD8 ו-CD69 ואת הקספאז-3 התוך-תאי ומראים ויסות נמוך של TCR. לעומת זאת, תימוציטים שטופלו במעכבים מציגים רמות נמוכות יותר של CD69 פלואורסצנטי וקספאז-3.

כדי להתחיל בטיפול בתימוציטים עם מעכבי קינאז, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 40 מיקרוליטר לבאר תימוציטים לצלחת בנפח קטן. שים את הצלחת על קרח. לאחר מכן, פיפטה חלק אחד של מעכבי קינאז, DMSO ודקסמתזון, וארבעה חלקים ממדיית ה-RPMI השלמה לתוך צלחת של 96 בארות.

ייעד שמונה בארות של הלוח בנפח קטן לבקרות לא מטופלות, ארבע בארות לבקרות חיוביות שטופלו בדקסמתזון למוות תאי, על ידי הוספת הדקסמתזון המדולל בריכוז של 5 מיקרומולריות, וארבע בארות לבקרות שטופלו ברכב על ידי הוספת 0.5 מיקרוליטר של ה-DMSO המדולל. לאחר מכן, מהבארות המתאימות של צלחת המעכב, הוסף 0.5 מיקרוליטר מכל מעכב מדולל לצלחת 96 הבארות.

כדי להתחיל בגירוי של תימוציטים, ראשית, ודא שחרוזי אנטי-CD3 ו-CD28 מושעים באופן אחיד. לאחר מכן, שטפו 1 מיליליטר מהחרוזים עם 2 מיליליטר של מאגר ה- PBS. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי כדי להפריד חרוזים מסופרנטנט, ושאבו את התמיסה. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים ב-1 מיליליטר של מדיום ה-RPMI השלם.

הוסף 10 מיקרוליטר לבאר של תרחיף החרוזים לכל דגימה שטופלה במעכב, ארבע הדגימות שטופלו ב-DMSO וארבע מתוך 8 הדגימות הלא מטופלות. הוסף 10 מיקרוליטר מה-RPMI השלם לארבע הבארות הנותרות שלא טופלו.

השתמש בשייקר אורביטלי מיקרופלייט כדי לערבב בעדינות את הצלחת. לאחר מכן, דגרו על התימוציטים בסביבה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 17 עד 20 שעות או למשך הלילה.

ראשית מכונת כביסה אוטומטית של צלחות זרימה למינרית, ראשית, עם 150 מיליליטר של תמיסת אתנול-טווין, לאחר מכן, עם מים נטולי יונים בתוספת 1% Tween-20, ולבסוף, עם מאגר כביסה FACS. בתום הדגירה, באמצעות מערכת שטיפת הצלחות, שטפו את הצלחת עם מאגר כביסה FACS באמצעות מחזור כביסה של תשע פעמים. כל שטיפה מוסיפה ומסירה 55 מיקרוליטר של מאגר כביסה על ידי זרימה למינרית, וכתוצאה מכך דילול אקספוננציאלי של הריאגנטים בבארות.

כדי להכתים אנטיגנים על פני השטח, ראשית, יש לדלל נפח יחידה אחת של נוגדנים נגד CD3, אנטי-CD4, אנטי-CD8 ואנטי-CD69 בנפחים של 100 יחידות של מאגר הכביסה של FACS. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-25 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים המצביעה. השתמש בשייקר מסלולי מיקרופלייט כדי לערבב בעדינות את הצלחת, ולאחר מכן השאיר את הצלחת על קרח למשך 30 דקות.

כדי לתקן את התאים, ראשית, שטפו את הצלחת עם 55 מיקרוליטר של מאגר כביסה FACS באמצעות מחזור כביסה של תשע פעמים כמתואר קודם. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר הקיבוע והחדירות לכל באר. מערבבים היטב, ומדגרים את הצלחת על קרח למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הכינו מאגר סלסול/כביסה 1x על ידי דילול 25 מיליליטר ממלאי 10x המסופק ב-225 מיליליטר מים טהורים במיוחד.

יש להניח את מכונת הכביסה עם מאגר 1x, ולשטוף את הצלחת עם 55 מיקרוליטר של המאגר 1x באמצעות מחזור כביסה של תשע פעמים כמתואר קודם. מערבבים 1 מיליליטר של הנוגדן נגד קספאז-3 עם 2 מיליליטר של 1x סלסול ומאגר כביסה. הוסף 25 מיקרוליטר לבאר מהתערובת לתאים הקבועים.

השתמש בשייקר אורביטלי מיקרופלייט כדי לערבב בעדינות את הצלחת. השאירו את הצלחת על קרח למשך שעה. בתום הדגירה, חזור על שלב הכביסה, תשע פעמים עם מאגר הסלסול והכביסה 1x. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר הכביסה FACS לכל בארות הצלחת, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב את התמיסה.

לבסוף, העבירו את הדגימות המעורבות לצינורות מיקרוטיטר. מלאו את הצינורות במאגר הכביסה FACS לנפח כולל של 200 מיקרוליטר והמשיכו לניתוח ציטומטריית הזרימה.