הפעלת מקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר בתגובה לנוגדנים

בעקבות חשיפה לפתוגן, מקרופאגים עוברים הפעלה ומשחררים ציטוקינים פרו-דלקתיים ואנטי דלקתיים, המתאמים את תגובת מערכת החיסון.

כדי לחקור את הפעלת המקרופאגים שמקורם במח עצם במבחנה, העבירו תרחיף תאי מח עצם מבודד של עכבר לבקבוק תרבית. דגירה קצרה.

התאים המזנכימליים, המונוציטים והמקרופאגים הבוגרים נצמדים למשטח הבקבוק בעוד האבות ההמטופויאטיים נשארים בתרחיף.

אסוף את המדיה המכילה אבות המטופויאטיים וצנטריפוגה. העבר את התאים התלויים מחדש בגורם מגרה מושבת מקרופאגים, M-CSF, מדיה לבקבוק תרבית.

M-CSF גורם לתת-אוכלוסיית האב המיאלואיד להתמיין למקרופאגים, שנראים מסועפים ונצמדים לבקבוק.

השליכו את המדיה שאינה מכילה תאים שאינה נדבקת. הוסף מדיית M-CSF ודגירה. ברגע שהמקרופאגים מגיעים למצב התפקודי המלא שלהם, קצרו אותם. צנטריפוגה.

מקרופאגים של לוחות מושעים במדיה M-CSF לבארות צלחות מרובות בארות. לאחר היצמדות מקרופאגים לבארות, הוסף אימונוגלובולינים פוליקלונליים אנושיים וליפופוליסכריד חיידקי, LPS, רעלן.

אימונוגלובולינים נקשרים לקולטני FCγ ספציפיים, בעוד LPS נקשר לקולטנים דמויי טול על מקרופאגים. גירוי משותף זה מניע הפעלת מקרופאגים אנטי דלקתיים באמצעות מפלי איתות במורד הזרם, וגורם לשחרור רמות גבוהות של ציטוקינים אנטי דלקתיים ורמות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים.

אסוף את המדיה המכילה ציטוקינים לניתוח נוסף כדי לאשר את הפעלת המקרופאגים.

אבטח עכבר שהומת על לוח קצף כשגפיו פרושות, ואז נקה את הרגליים עם 70% אתנול. לאחר מכן, בצע חתך רדוד בעומק של כ -2 מילימטר כדי להסיר את העור והפרווה מפני השטח של כל רגל אחורית. לאחר מכן, נתחו את הרקמות כדי לגשת לטיביה ולעצם הירך.

כדי להסיר את השוקה ועצם הירך, חתכו את העצם והשרירים ממש מתחת למפרק הירך ומעל הקרסוליים. לאחר מכן, הסר כמה שיותר מרקמת השריר מהעצמות. לאחר מכן, נקו את העצמות עם 70% אתנול והניחו לו להתאדות למשך דקה אחת, ולאחר מכן, הניחו את העצמות בצלחת בת 6 בארות מלאה במדיום שטיפת עצם.

בצלחת, חתוך 1 מילימטר משני קצות עצם הירך כך שהחללים הפנימיים שלהם ייחשפו. ודא שמחט בגודל 26 יכולה לגשת לחללים. לאחר מכן, הפרד את השוקה ועצם הירך ממפרק הברך. לאחר מכן, הכנס את המחט המחוברת למזרק של 10 מיליליטר לחלל עצם ואסוף את מח העצם.

אסוף את מח העצם מכל 4 העצמות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם 5 מיליליטר של מדיום שטיפת עצם. פיפטה את המדיום ומח העצם למעלה ולמטה מספר פעמים, או מערבולת במהירות איטית כדי לפזר בעדינות גושים במתלה. יש לפרק מחרוזות מח לכתמים קטנים של מח באורך של פחות מחצי מילימטר.

לאחר מכן, מלאו את הצינור ל-50 מיליליטר עם מדיום שטיפת עצם והעבירו אותו לבקבוק תרבית רקמות בגודל 75 סנטימטר רבוע. דגרו על מח העצם למשך שעה. במהלך הדגירה, התאים הבוגרים ידבקו לבקבוק והאבות ההמטופויאטיים הרצויים יישארו בתרחיף. העבירו את התרחיף לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, וסובבו את התאים לכדור.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדור התא ב-5 מיליליטר של מדיום תרבית MCSF. לאחר מכן, התאם את צפיפות התאים ל-500,000 למיליליטר וטען 30 מיליליטר לבקבוק חדש של 75 סנטימטר רבוע. המשך בתרבית התאים ובימים 4, 7 ו-10, ודא שהתאים דבוקים ומסועפים מעט באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ניגודיות פאזה הפוכה.

בעת בדיקת התאים, השליכו את המדיום המכיל את התאים הלא נדבקים. לאחר מכן, שטפו את התאים הדבקים עם IMDM פעם אחת, והוסיפו 30 מיליליטר של מדיום תרבית MSCF טרי בחזרה לבקבוק. ביום ה-10, החלף את המדיום ב-8 מיליליטר של מאגר דיסוציאציה של תאים מבוסס EDTA ללא אנזימים כדי לאסוף את התאים. דגרו את התאים לזמן קצר, לאחר מכן, גרדו את התאים בעדינות וודאו שהם השתחררו באמצעות מיקרוסקופ.

לאחר שחרור התאים, העבירו את המאגר עם התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואז שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם 5 מיליליטר IMDM כדי לאסוף תאים נוספים. אסוף את כל האוספים, צנטריפוגה אותם והשהה מחדש את הגלולה ב-3 מיליליטר MCSF. כעת, ספרו את התאים והתאימו את ריכוזם למיליון למיליליטר.

לאחר מכן, צלחת 100 מיקרוליטר של מתלה תאים לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. הצלחת כולה צריכה להיות ניתנת למילוי. תרבית התאים כשעה עד שהם נדבקים. לאחר מכן, עורר אותם עם ריכוזים שונים של LPS או אימונוגלובולין תוך ורידי או שניהם, שהוכנו ב-IMDM. בצע את כל המניפולציות בשכפול או משולש והקפד לשמור על בקרות לא מטופלות, לאחר מכן, דגר על התאים למשך 24 שעות ונתח את הסופרנטנטים.