הערכה של חסינות הנגרמת על ידי חיסון מפני זיהום חיידקי במודל עכבר

כדי לחקור חסינות הנגרמת על ידי חיסון, קח זריקה מלאה בחיסון שעלת תאי. החיסון מכיל חלבונים אנטיגניים של חיידק הגורם למחלות נשימה - בורדטלה שעלת, ואדג'ובנטים המרחיבים את החשיפה לאנטיגן לתגובה חיסונית מתמשכת.

יש להזריק את החיסון תוך שרירי לעכבר מורדם.

לאחר ההזרקה, התאים מציגי האנטיגן המקומיים, APCs, לוכדים ומעבדים את החלבונים האנטיגניים לפפטידים, ומציגים אותם על פני השטח שלהם. APCs אלה נודדים לאחר מכן לבלוטות לימפה סמוכות ומקיימים אינטראקציה עם תאי T, ומתחילים את הפעלתם והתמיינותם לתאי T אפקטיביים.

תאי T אפקטורים אלה מסתובבים ונודדים לאיברים שונים, כולל הריאות, שם הם שוכנים כתאי זיכרון T או תאי_{T RM}, מה שמוביל לחיסון.

לאחר החיסון, יש לתת דרך האף זן עמיד לאנטיביוטיקה של שעלת בורדטלה חיה. חיידקים אלה נכנסים לרקמת הריאה ומפעילים תאי_{T RM}. תאי ה-T_RM המופעלים מפרישים ציטוקינים דלקתיים המגייסים את תאי החיסון כדי לגרום לפינוי חיידקים.

קצרו את רקמת הריאה של העכבר והומוגניזציה שלה כדי לקבל תרחיף של תא בודד. מורחים את תרחיף התאים המדולל על צלחת אגר המכילה אנטיביוטיקה ודוגרים אותה כדי לאפשר היווצרות מושבת חיידקים.

תמצית הרקמה מעכבר מחוסן מציגה פחות מושבות בהשוואה לזו של עכבר לא מחוסן, מה שמאשר חסינות הנגרמת על ידי חיסון נגד שעלת בורדטלה.

לצורך חיסון, יש לאשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן בעכבר מורדם בן 6 עד 12 שבועות ולטעון מזרק אינסולין בנפח 1 מיליליטר המצויד במחט בגודל 28.5 עם 0.1 מיליליטר של החיסון המעניין. החזיקו את המזרק בזווית של 45 מעלות כשהשיפוע פונה כלפי מעלה, הכניסו את המחט כ-5 מילימטרים לתוך הדלתא של העכבר, והזריקו את החיסון.

שמור את המחט מוחדרת לשריר למשך 5 עד 10 שניות. לאחר מכן, סובב את המזרק 180 מעלות כך שהשיפוע פונה כלפי מטה כדי ליצור אטימה, וכדי למנוע דליפת חיסון לפני החזרת המחט לאט ממקום ההזרקה. לאחר מכן, החזר את העכבר לכלוב שלו עם ניטור עד להתאוששות מלאה.

כשבועיים לאחר הדחף, הדביקו עכברים מחוסנים. אחוז בעכבר מורדם על ידי קשקוש בית החזה הגבי מאחורי השכמות והצוואר, ומקם את העכבר זקוף כדי לגשת לאף. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, מרחו לאט 20 עד 25 מיקרוליטר של החיסון החיידקי המעניין על כל שכבה של החיה, והחזיקו את העכבר עד לשאיפת החיסון כולו. לאחר מכן, העבירו נפח שווה של PBS סטרילי לקבוצת עכברים אחת כביקורת שלילית.

בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, הנח צד גחון של עכבר נגוע כלפי מעלה על לוח דיסקציה, ואבטח את הגפיים. הרטיבו את הגוף עם 70% אתנול והשתמשו במלקחיים כדי לאחוז את העור מתחת לבטן במרכז האגן. בעזרת מספריים חדים, בצע חתך אנכי עד הלסת התחתונה, ונתח את העור מדופן הצפק. הזיזו את העור לצידי הפגר כדי ליצור שדה ללא הפרעה לקצירת איברים סטריליים, ותפסו את הצפק השלם מתחת לכלוב הצלעות בכבד או בקרבתו. חותכים את הצפק לכיוון כלוב הצלעות כדי לחשוף את מערכת העיכול התחתונה, ומזיזים את המעי הגס שמאלה כדי לחשוף את הטחול.

בעזרת מלקחיים מעוקלים, אחזו בטחול ונתחו את רקמת החיבור בעזרת מספריים. לאחר מכן, הניחו את הטחול בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר RPMI, וסרום בקר עוברי 5% על קרח. השתמש במלקחיים כדי לייצב את כלוב הצלעות בתהליך ה-xiphoid, וחתוך את הסרעפת. הריאות צריכות להתרוקן וליפול לכיוון עמוד השדרה.

חותכים את כלוב הצלעות בצדדים כדי להסיר את החושן, וחותכים את עורקי הריאה והוורידים כדי לבודד ולהסיר את האונה העליונה של הריאה הימנית. מקבעים את האונה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר של פורמלין ניטרלי 10% בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפחות, ומבודדים את האונות הנותרות של הריאה הימנית והשמאלית. לאחר מכן, הניחו אונות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של 1% קזאין ב-PBS על קרח.

השתמש ב-PIPETMAN של 1 מיליליטר עם קצה כדי לאסוף את הדם הממלא את חלל החזה, ולהעביר את הדם לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר מסומן מראש על קרח. הסר את הבלוטות הפרוטידיות, התת-לשוניות והתת-מקסילריות, ובלוטות הלימפה המכסות את קנה הנשימה, ופתח והסר את ממברנות המגן המקיפות את קנה הנשימה. בעזרת מלקחיים ומספריים עדינים, הפרד בזהירות את קנה הנשימה מהוושט, וכל רקמת חיבור אחרת מהחלק העליון של עצמות הבריח לתחתית הלסת התחתונה.

השתמש במלקחיים כדי להחזיק את קנה הנשימה, וחתוך את קנה הנשימה בחלק העליון של עצם הבריח. משוך כלפי מטה את קנה הנשימה כדי למקסם את האלסטיות, וחתוך את קנה הנשימה בתחתית הלסת התחתונה ממש מעל הגרון, תוך בידוד של כסנטימטר אחד של רקמה. לאחר מכן, הניחו את האיבר בצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן מראש בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 0.3 מיליליטר של 1% קזאין ב-PBS על קרח.

כעת, סובב את העכבר לגישה ברורה לאף, ורסס את הראש באתנול 70%. באופן ידני, תפסו את החיה ישירות מאחורי הגולגולת, והשתמשו במספריים כדי לחתוך את הבשר הרך של החוטם, החל מתחתית האף ונע כלפי מעלה. הסר את הפרווה, העור והשפם מסביב לאף, והכנס את קצות המספריים המעוקלים לתוך הנאר כשהקימורים מופנים כלפי מטה.

חותכים את מעבר האף לכיוון העיניים ויוצרים תצורה דמוית V. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי לאסוף את מחיצת האף, ואת הרקמה הרכה בתוך התצורה, והנח את הרקמה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל 0.3 מיליליטר של 1% קזאין ב-PBS על קרח.

כדי לעבד את רקמת הריאה, העבירו את כל תוכן צינור דגימת הריאה להומוגניזטור סטרילי של 15 מיליליטר, והשתמשו בעלי כדי להומוגניזציה של הרקמה. נתק את הדגימה עד שלא יישארו חלקיקים גדולים של רקמה, והחזר את התרחיף ההומוגני לצינור המקורי של 15 מיליליטר. הסר אליקוט של 0.3 מיליליטר לציפוי יחידות יוצרות מושבה, ואסוף את שאר ההומוגנאט על ידי צנטריפוגה.

יש לשים 0.5 מיליליטר של הסופרנטנט לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים מראש לאחסון בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח ביטוי ציטוקינים על ידי ELISA. לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי 0.1 מיליליטר של תרחיף הריאות ההומוגני שהופרש ב-0.9 מיליליטר של PBS סטרילי לכל דילול, ולהשתמש במפזר משולש סטרילי כדי לצלחת 0.1 מיליליטר מכל דילול שנבחר אמפירית על לוחות 10% בורדט-ג'נגו בתוספת סטרפטומיצין.