אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:24 דק׳ • July 8th, 2025
קולטני תאי B, BCRs, על לימפוציטים מסוג B, קושרים אנטיגנים וגורמים להפעלת תאים. זה מוביל להפנמת אנטיגן לעיבוד לשברי פפטיד, אשר נטענים על מולקולות MHC מסוג II להצגה ללימפוציטים T מסייעים ליצירת תגובה חיסונית יעילה.
כדי לחקור את הפעלת לימפוציטים B במבחנה באמצעות חרוזים מצופים אנטיגן, ראשית, השג חרוזים מצופים אנטיגן. חרוזים אלה מצופים קוולנטית באנטיגנים, ליגנדים ספציפיים ל-BCRs; חלבון לא מגיב חוסם את אתרי החרוזים הלא קשורים, ומונע קשירת לימפוציטים B לא ספציפיים.
הוסף את החרוזים לתרחיף לימפוציטים B. זרעו את התערובת על כיסוי מצופה פולי-ליזין.
לימפוציטים B בעלי מטען שלילי נקשרים לכיסוי הטעון חיובית, ומשתקים את התאים. יתר על כן, האנטיגנים של החרוזים נקשרים במיוחד ל-BCR. האינטראקציה של ה-BCR עם האנטיגן מפעילה לימפוציטים מסוג B, ויוצרת צומת הדוק - סינפסה חיסונית.
האינטראקציה יוזמת מסלולי איתות תוך תאיים, וכתוצאה מכך ארגון מחדש של שלד הציטו של אקטין. זה גורם להתפשטות קרום התא ואחריו להתכווצות, שבמהלכה מתרכז המיקרו-אשכול של BCR-אנטיגן במרכז הסינפסה החיסונית.
עם שיפוץ אקטין, הצנטרוזום - מרכז ארגון מיקרו-צינוריות - מתמקם מחדש ליד הסינפסה. המיקום מחדש מגייס אברונים כמו ליזוזומים ומנגנון גולגי ליד הסינפסה החיסונית כדי לחלץ ולהציג אנטיגנים.
חרוזים מצופים אנטיגן מוכנים על ידי דגירה של ליגנדים ספציפיים עם חרוזי אמינו שטופלו בעבר בגלוטרלדהיד להפעלת קבוצות אמינו. השעו מחדש חרוזים מופעלים ב -100 מיקרוליטר PBS ומערבולת. בינתיים, הכינו את תמיסת האנטיגן על ידי הוספת 100 מיקרוגרם למ"ל ליגנד BCR ב -150 מיקרוליטר PBS.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזים פעילים לתמיסת האנטיגן, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זכור, השתמש גם בליגנד שאינו קשור כבקרה שלילית. לאחר הדגירה יש לשטוף את החרוז עם PBS, לשאוב את הסופרנטנט ולהחליף ב-PBS. חזור על הפעולה שלוש פעמים. לאחר מכן, חסום את קבוצות האמינו החופשיות על ידי השעיית חרוזים ב -500 מיקרוליטר של תמיסה של BSA. לבסוף, השעו מחדש חרוזים ב -70 מיקרוליטר PBS.
כדי לחשב את הריכוז הסופי, אתה יכול להשתמש בהמוציטומטר כדי לספור את החרוזים. להפעלת תאי B, השתמש בשפופרת של 50 מ"ל והשהה את התאים לריכוז של 1.5 מיליון למ"ל ב-CLICK בתוספת סרום בקר עוברי 5%. לאחר מכן, הוסף 150,000 תאי B המתאימים ל-100 מיקרוליטר של תערובת חרוזי התא לכיסוי מצופה פולי-L-ליזין, ודגירה ב-37 מעלות עבור נקודות הזמן השונות.