השפעת נוגדן Anti C-fms על אוסטאוקלסטוגנזה בתאי מח עצם עכבר במבחנה

אוסטאוקלסטוגנזה הוא התהליך שבו מבשרי אוסטאוקלסטים מתמיינים ומתמזגים ליצירת אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים.

כדי לחקור את ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על אוסטאוקלסטוגנזה במבחנה, קח צלחת תרבית המכילה תרחיף תאי מח עצם של עכבר. הוסף גורם מגרה מושבת מקרופאגים, M-CSF.

בתרבית, M-CSF נקשר לקולטן הספציפי שלו, c-fms, על תאי מבשר מיאלואידים, מפעיל מסלולי איתות וגורם להתמיינות למקרופאגים של מח העצם, BMMs, המייצגים מבשרי אוסטאוקלסטים ונצמדים לצלחת.

הסר את התאים שאינם נדבקים. קצרו את ה-BMMs, וזרעו אותם על בארות צלחות מרובות בארות. תוסף עם M-CSF ומפעיל קולטן של ליגנד הגורם הגרעיני kappa-Β, RANKL.

הוסף ריכוזי נוגדנים הולכים וגדלים נגד c-fms לבארות.

בבאר הבקרה, M-CSF נקשר לקולטני c-fms ומפעיל מסלולי איתות, ממריץ את ביטוי קולטני RANK ומקדם הישרדות והתפשטות של BMM. RANKL נקשר לקולטני RANK, מפעיל מפל איתות וגורם להתמיינות BMM ואיחוי לאוסטאוקלסטים.

בבארות עם ריכוזי נוגדנים גבוהים יותר, הנוגדנים נקשרים וחוסמים ביעילות את קולטני c-fms ומשבשים את האיתות הנדרש להתמיינות אוסטאוקלסטים, ובכך מעכבים היווצרות אוסטאוקלסטים.

בצע צביעה כדי לזהות ולכמת את אוכלוסיות האוסטיאוקלסטים ולקבוע את ריכוז הנוגדנים היעיל לעיכוב אוסטאוקלסטוגנזה בהיווצרות אוסטאוקלסט המושרה על ידי RANKL.

זרעו 10 מיליון תאים ל-10 מיליליטר בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים, והוסיפו M-CSF לתאים. דגרו את התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 3 ימים. הסר את המדיום לאחר שלושה ימים, ושטוף את התאים פעמיים, במרץ, עם 10 מיליליטר PBS להסרת תאים שאינם נדבקים.

הוסף 5 מיליליטר של טמפרטורת החדר 0.02% טריפסין-EDTA ב-PBS, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 5 דקות. פיפטה היטב את התאים כדי לנתק אותם. התבונן בתרבית תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נותקו ונראים מעוגלים וצפים במדיה.

כאשר התאים נותקו, השביתו את התגובה על ידי הוספת 5 מיליליטר של אלפא-MEM. אוספים את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט יש לשטוף עם 5 מיליליטר אלפא-MEM וצנטריפוגה שוב ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר אלפא-MEM.

זרע מיליון תאים ל -10 מיליליטר בצלחת תרבית של 10 סנטימטר, והוסף M-CSF. דגרו את התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 3 ימים. קצור את התאים המחוברים, המייצגים BMMs כמבשרי אוסטאוקלסטים לאחר 3 ימים. זרעי BMMs ב-50,000 תאים לכל 200 מיקרוליטר אלפא-MEM בצלחת של 96 בארות, לכל באר.

לכל באר מוסיפים את הגירויים הרצויים, ולאחר מכן מוסיפים M-CSF לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר. הוסף נוגדן נגד c-fms לכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 4 ימים, תוך החלפת מדיה כל יומיים למשך 4 ימים, ולאחר מכן המשיכו בצביעה ובדיקות כמתואר בכתב היד.