JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:50 דק' • July 8th, 2025
נתרן דקסטרן סולפט, או DSS, גורם לקוליטיס - מחלת מעי דלקתית - שבה הפרעה במחסום האפיתל של המעי מובילה לדלקת.
כדי להעריך נזק לרקמות, קח רקמת מעי גס קבועה שבודדה ממודל עכברי של קוליטיס הנגרמת על ידי DSS. טבלו את הרקמה במדיום הטבעה לחיתוך קל, והקפיאו במהירות.
בעזרת מיקרוטום קריו, השג קטע רקמה דק ואסוף אותו על מגלשת זכוכית.
טבלו את השקופית בתמיסה המכילה צבע המטוקסילין מחומצן הקשור למורדנט - קטיון מתכת - המקנה מטען חיובי לצבע. קומפלקס הצבע נקשר ל-DNA בעל מטען שלילי, ומכתים את הגרעין בצבע סגול-אדמדם.
טבלו את הרקמה בתמיסת חומצה-אלכוהול מבדילה, והסירו צבע שאינו קשור במיוחד מהציטופלזמה ומהמטריצה החוץ-תאית. שטפו את הרקמה בחומר מכחלחל - מדיום אלקליין - המקנה צבע כחול לגרעינים, ומגביר את הניגודיות.
טבלו את המגלשה בריכוזי אלכוהול הולכים וגדלים כדי לייבש את הרקמה ולשפר את חדירת הכתמים הנגדיים.
טבלו את הרקמה בכתם הנגדי - תמיסת אאוזין חומצית - המעניקה צבע ורוד לחלבונים הציטופלזמיים הבסיסיים ולמטריצה החוץ-תאית. שטפו את השקופית באלכוהול כדי להסיר עודפי אאוזין. טבלו את הרקמה בקסילן כדי להפוך את הרקמה לשקופה - לבדיקה מיקרוסקופית טובה יותר.
תחת מיקרוסקופ, החלק של המעי הגס מראה נזק מחמיר לרקמות, המעיד על קוליטיס הנגרמת על ידי DSS.
לצביעת המטוקסילין ואאוזין של רקמת המעי הגס המבודדת, למחרת בבוקר, טבלו את חתיכות הרקמה ב-30% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה בצינורות בודדים של 15 מיליליטר להגנה על הדגימות. למחרת, הטמיעו את הרקמות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית או בתרכובת OCT וקררו את הרקמות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שה-OCT מתקשה.
הנח את קוביות ה-OCT בקריוסטט והגדר את חוגת העובי ל-12 מיקרומטר, ולאחר מכן, פורס ואסוף חלקים קפואים בעובי 12 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. לאחר שכל הרקמות נחתכו, יש לחמם את השקופיות ב-65 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך 20 דקות, ולשטוף את החלקים המחוממים לזמן קצר במים מזוקקים לפני הצביעה בתמיסת צביעה של המטוקסילין למשך 5 דקות.
הסר את תמיסת ההמטוקסילין העודפת במי ברז זורמים למשך 5 דקות, והבדיל בין החלקים עם 0.5% חומצה הידרוכלורית באתנול למשך 30 שניות, ולאחר מכן שטיפה של דקה אחת תחת מי ברז זורמים. לאחר מכן, שטפו את הדגימות במשך דקה אחת ב-PBS, ולאחר מכן שטיפה נוספת של 5 דקות תחת מי ברז זורמים.
בתום הכביסה, טבלו את הרקמות בסדרת אתנול עולה למשך 10 שניות לכל טבילה, ולאחר מכן צביעה נגדית באאוזין למשך 2 דקות. לייבוש הדגימות, טבלו את השקופיות ב-95% אתנול ו-2 שינויים של 100% אתנול למשך 5 דקות לכל טבילה, ולאחר מכן ניקוי עם שני שינויים של 5 דקות בקסילן. לאחר מכן, ציון הנזק לרקמות במעי הגס הפרוקסימלי, האמצעי והדיסטלי של כל קבוצת ניסוי.