סינתזת ביופילם חוץ גופית מאת Staphylococcus aureus

ביופילמים חיידקיים הם מבנים תלת מימדיים המורכבים מקהילות חיידקים המוטמעות במטריצה חוץ-תאית שנוצרת בעצמה, אשר מתחמקות מהתגובה החיסונית של המארח.

להכנת ביופילם סטפילוקוקוס זהוב במבחנה, העבירו תרחיף סטפילוקוקוס זהוב הגדל באופן פעיל של צפיפות התאים הרצויה לבארות מצופות פולי-L-ליזין של צלחת מרובת בארות.

במהלך הדגירה בתנאים סטטיים, ציפוי הפולי-L-ליזין הטעון חיובית מקל על אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם הגליקופולימרים הטעונים שלילית, כגון חומצות טיכואיות, על פני השטח של החיידקים, ומקדם התקשרות חיידקית.

עם מקורות תזונתיים זמינים, סטפילוקוקוס זהוב מתחלק ומצטבר ויוצר מיקרו-מושבות. בנוסף, החיידקים מפרישים מטריצה חוץ-תאית הכוללת פוליסכרידים, חלבונים ו-DNA חוץ-תאי, העוטף תאים ומקדם לכידות חיידקים והידבקות פני השטח.

עם המשך חלוקת התאים והפרשת המטריצה, הביופילם מבשיל למבנה תלת מימדי עם הפצת מולקולות איתות יעילה לתקשורת בין תאים.

בהגיעו לצפיפות חיידקים סף, סטפילוקוקוס זהוב מפריש פרוטאזות ונוקלאזות, משפיל את מטריצת הביופילם ומשחרר כמה סטפילוקוקוס זהוב למדיה. הסר את המדיה המכילה חיידקים פלנקטוניים צפים חופשיים.

הוסיפו בעדינות חוצץ כדי למנוע שיבוש בביופילם. הסר את המאגר המכיל את כל החיידקים שנותרו לא מחוברים.

הביופילם שנוצר מוכן לניסויים במורד הזרם.

התחל בהשגת מושבות מבודדות של סטפילוקוקוס זהוב מציר משומר בהקפאה באמצעות טכניקת צלחת פסים על צלחת אגר עשירה בחומרים מזינים כגון אגר סויה טריפטית. מצפים בארות בודדות של צלחת של 96 בארות עם 100 מיקרוליטר PLL מדולל במים סטריליים, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שאפו את תמיסת ה-PLL באופן אספטי, באמצעות מלכודת שאיפה בעזרת ואקום. הניחו לבארות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

הכינו תרבית לילה על ידי חיסון מושבה של S. aureus ב-MEM-alpha בתוספת 2% גלוקוז, ודגרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות ב-200 סיבובים לדקה. יש לדלל את תרבית הלילה על ידי העברת 50 מיקרוליטר ל-5 מיליליטר של MEM-אלפא טרי בתוספת 2% גלוקוז. לאחר מכן, דגרו אותו ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סיבובים לדקה עד להשגת שלב לוגריתמי אמצעי. השתמש ב-MEM-alpha כדי לנרמל תרבית לוגריתמית בינונית ל-OD של 0.1.

העבירו 150 מיקרוליטר של תרבית מנורמלת לכל באר בצלחת 96 הבארות שטופלה ב- PLL. דגרו את הצלחת בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 20 שעות. שאפו את הסופרנטנט כדי להסיר את התאים הפלנקטוניים. יש לשטוף בעדינות את הביומסה שנותרה עם 150 מיקרוליטר HBSS כדי להסיר את התאים הלא מחוברים. חזור על הפעולה לפחות פעמיים כדי להסיר את כל התאים הפלנקטוניים.