טכניקת מבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות חיידקים פתוגניים

כדי לעורר לימפוציטים באמצעות המופילוס אינפלואנזה - חיידק פתוגני, קח תרחיף של תאים חד-גרעיניים מבודדים בדם היקפי, או PBMCs, כולל לימפוציטים ותאים מציגי אנטיגן או APCs.

הוסף תרחיף חיידקים ודגירה בטמפרטורה פיזיולוגית.

קולטנים לזיהוי דפוסים על ה-APCs נקשרים לרכיבים ספציפיים של תאי החיידקים, ומעוררים פגוציטוזיס. הפגוזום - המכיל חיידקים מופנמים - מתמזג עם הליזוזום, גורם לפירוק חיידקים ועיבוד לשברי פפטיד.

קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי או מולקולות MHC נקשרות לשברי הפפטיד ומציגות אותם על פני התא כאנטיגנים. לימפוציטים מסוג T נקשרים לאנטיגן המוצג באמצעות קולטן תאי T.

הוסף נוגדנים לגירוי משותף הנקשרים לקולטני שטח ספציפיים על לימפוציטים מסוג T. הקישור הסינרגטי גורם לאיתות במורד הזרם, ומפעיל ייצור ציטוקינים לימפוציטים מסוג T.

הוסף תרכובת חוסמת גולגי - החוסמת את הובלת החלבון השלפוחית מהרטיקולום האנדופלזמי לגולגי - כדי לעכב הפרשת ציטוקינים מלימפוציטים מסוג T, מה שמקל על הצטברות ציטוקינים תוך תאיים.

הוסף מקבע לשימור מורפולוגיה תאית וחומר ניקוי כדי לחלחל את קרום התא. הוסף קוקטייל של נוגדנים עם תווית פלואורסצנטית, כולל נוגדנים הנקשרים לסמני פני השטח הספציפיים ללימפוציטים T - המסמנים את פני התא - ונוגדנים ספציפיים לציטוקינים החודרים לתוך התא כדי לקשור ציטוקינים תוך תאיים.

בצע ציטומטריית זרימה כדי לזהות תאים עם פלואורסצנציה כפולה - מה שמעיד על ייצור ציטוקינים על ידי לימפוציטים T מגורים.

חלקו את דגימת הדם ההיקפית לאליקוטים לבקרה וגירוי אנטיגן. הוסף נוגדנים מעוררים לשתי הדגימות, ולאחר מכן הוסף את H. influenzae שאינו ניתן לסוג לדגימת האנטיגן, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה.

לאחר מכן, הוסיפו את החומר חוסם גולגי ברפלדין A לדגימות ודגרו אותן למשך חמש שעות נוספות. לאחר ליזה של האריתרוציטים כפי שהודגם קודם לכן, יש לתקן את הלויקוציטים באמצעות 500 מיקרוליטר של 1% עד 2% פרפורמלדהיד למשך שעה. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, ואז חדרו למיליון תאים עם 100 מיקרוליטר של 0.1% ספונין למשך 15 דקות.

לאחר מכן, דגרו על התאים עם נוגדנים מתאימים עם תווית פלואורסצנטית. שטפו את התאים ואז נתחו אותם באמצעות ציטומטר זרימה. קבע את שיעור התאים המגיבים לאנטיגן על ידי שער אוכלוסיות הלימפוציטים הרלוונטיות. בצע צביעת רקע על תאים לא מגורים עבור כל הציטוקינים שיש לנתח.