$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
במהלך זיהום, לימפוציטים מופעלים משחררים מתווכים דלקתיים - ציטוקינים - כדי לעורר תגובה חיסונית.
כדי לכמת מתווכים דלקתיים ברקמה נגועה, התחל עם תרחיף תאים המכיל תאים חיסוניים שמקורם ברקמת ריאה אנושית.
דגרו על התאים עם המופילוס אינפלואנזה - חיידק פתוגני נשימתי. אנטיגנים פני השטח של החיידקים מקיימים אינטראקציה עם קולטנים לזיהוי דפוסים בתאי חיסון פגוציטים. זה יוזם הפנמת חיידקים, עיבוד לפפטידים קטנים יותר והצגת הפפטיד על ידי מולקולת קומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרית.
מולקולת האנטיגן-MHC-II על תאים פגוציטים נקשרת ללימפוציטים מסוג T דרך קולטני תאי T, יחד עם אינטראקציות קולטני גירוי משותף, וכתוצאה מכך הפעלת לימפוציטים מסוג T וייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים.
טפל בתאים עם חוסמי גולגי, הפוגעים בשחרור ציטוקינים - מה שגורם להצטברות שלהם בתוך התאים. שטפו את התאים עם מאגר חוסם כדי לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים.
צבעו את תרחיף התא בתערובת של נוגדנים המסומנים בפלואורופור הנקשרים במיוחד לסמני פני השטח של לימפוציטים מסוג T אנושיים, ומאפשרים תיוג של לימפוציטים.
תקן את התאים וחדור אותם בעזרת חומר פעילי שטח היוצר נקבוביות. דגרו על התאים החדירים עם נוגדנים אנטי-ציטוקינים המסומנים בפלואורופור, הנכנסים לתאים ומקיימים אינטראקציה עם ציטוקינים ספציפיים.
באמצעות ציטומטריית זרימה, מדוד את אות הקרינה של הציטוקינים בתוך לימפוציטים מסומנים, בקורלציה עם ייצור מתווך דלקתי עקב זיהום חיידקי.
פורסים כ -20 עד 40 גרם מדגימת כריתת האונה לחלקים של 3 עד 5 מילימטר מעוקב. הנח אותם בתוך תא סטרילי של 50 מיקרוליטר, ושבר מכנית את הרקמה באמצעות מפרק מתאים. לאחר פירוק רקמות, יש ליז את תאי הדם האדומים כפי שהודגם ולהשעות מחדש את התאים ב-RPMI סטרילי. לאחר מכן, סנן את התאים דרך רשת ניילון סטרילית של 100 מיקרומטר, וספור את מספר התאים ברי הקיימא בשיטת אי הכללת הטריפאן הכחול.
לצורך בדיקת הזיהום, יש להשעות מחדש את תאי הריאה ב-RPMI לריכוז סופי של 4 מיליון תאים למיליליטר לשפופרת. לאחר מכן, הדביקו את התאים ב-MOI של 100 חיידקים לתא. שחרר את המכסה חצי סיבוב כדי לאפשר העברת גז בצינורות. הנח את התאים במסובב הצינור, ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס, תוך סיבוב ב-12 סל"ד. שעה לאחר הגירוי, הוסיפו את ברפלדין A כדי למנוע ייצוא חוץ-תאי של ציטוקינים, ודגרו על תרחיפי התאים למשך 16 עד 22 שעות נוספות עם סיבוב.
למחרת, שטפו את תרחיף התאים עם 500 מיקרוליטר PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר ו-0.01% נתרן אזיד. לאחר מכן, הישארו בתרחיף התאים עבור סמני פני שטח ספציפיים של תאי לימפוציטים אנושיים למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS וקבעו וחודרו אותם, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, דגרו על התאים עם נוגדנים תוך-תאיים לצביעה ציטוקינים למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את התאים והשעו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS, לפני איסוף נתונים על ציטומטר זרימה.