קביעת ייצור ROS על ידי נויטרופילים באינטראקציה עם ביופילם אופסוני

חיידקים המתויגים באופסונינים מזוהים על ידי קולטני נויטרופילים ספציפיים, המעוררים פגוציטוזיס עם מיני חמצן תגובתיים, או ROS, שחרור ופירוק חיידקים.

כדי לכמת את ייצור ה- ROS על ידי נויטרופילים במבחנה, קח צלחת מרובת בארות. באר הבדיקה מכילה ביופילם Staphylococcus aureus המורכב מחיידקים משובצים בסרט מטריצה חוץ-תאי. באר הבקרה היא ללא הביופילם.

דגרו על הביופילם עם סרום אנושי, מה שמאפשר לאופסונינים בסרום להפוך את הביופילם לאופסוניזציה.

שאפו את הסרום. שוטפים עם חיץ, מסירים אופסונינים לא קשורים. הוסף נויטרופילים ולומינול - תרכובת כימילומינסנט לבארות. צנטריפוגה, המקרבת את הנויטרופילים לביופילם.

בעזרת קורא צלחות, מדוד את הזוהר לאורך זמן.

בבאר המכילה ביופילם, נויטרופילים נקשרים לאופסונינים של הביופילם, וגורמים להפעלת נויטרופילים ולהפנמת חיידקים לפאגוזומים. מסלולי איתות ספציפיים מופעלים, וגורמים להרכבת NADPH אוקסידאז על פגוזומים.

NADPH אוקסידאז מזרז העברת אלקטרונים מ-NADPH לחמצן מולקולרי, ומייצר ROS שמפרק חיידקים. יתר על כן, NADPH אוקסידאז על קרום התא משחרר ROS מחוץ לתא

.

בתגובה, חיידקי ביופילם מייצרים אנזימים המנטרלים ROS ומשחררים לויקוצידינים היוצרים נקבוביות בממברנות נויטרופילים וגורמים לליזה, המשבשים את ייצור ה-ROS. לומינול מגיב עם ROS, גורם לעירור שלו, ופולט זוהר עם הרפיה.

באר הבדיקה מציגה רמות ROS מוגברות בהשוואה לביקורת, מה שמעיד על אינטראקציות ביופילם עם נויטרופילים.

הוסף 100 מיקרוליטר של 20% סרום אנושי רגיל מדולל ב-HBSS, טיפתי, לביופילם השטוף, ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפוך את הביופילם לאופסוני. שאפו את תמיסת הסרום, ושטפו את הביופילמים, עם 150 מיקרוליטר של HBSS. שאפו את ה-HBSS, והשאירו אחריהם בארות עם ביופילמים אופסוניים.

הוסף לומינול לנויטרופילים המושעיים ב-HBSS כדי ליצור ריכוז סופי של 5 מיקרו-לומינול. פתרון זה מוכן לשימוש עבור קבוצות A ו-C. הוסף נויטרופילים מעורבבים עם לומינול לבארות עם ביופילמים אופסוניים.

עבור קבוצה D, הכינו 50 תמיסת לומינול מיקרו-מולרית ב-HBSS בשפופרת נפרדת ללא נויטרופילים, והוסיפו אותה לבאר המכילה את הביופילם. יש להוסיף 350 מיקרוליטר נויטרופילים מעורבבים עם לומינול, ולהוסיף PMA בריכוז סופי של 500 ננוגרם למיליליטר לתערובת.

עבור קבוצה B, הוסיפו את הנויטרופילים מתערובת זו לבארות ללא ביופילם. זה משמש כשליטה חיובית. צנטריפוגה של הצלחת ב -270 RCF למשך 30 שניות ב -4 מעלות צלזיוס. ודא שקורא הלוחות מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס, הזוהר והקריאה הקינטית למשך 60 דקות במרווחים של 3 דקות.

הנח את הצלחת בקורא הצלחות כדי למדוד את ייצור ה- ROS על ידי נויטרופילים למשך 60 דקות.