בדיקת מבחנה לחקר האינטראקציה בין נויטרופילים וביופילם

ביופילם הוא קהילה של חיידקים דבוקים לפני השטח המוטמעים בתוך מטריצה של חומרים פולימריים חוץ-תאיים, EPS, ממקור מיקרוביאלי.

כדי לחקור אינטראקציות בין תאים חיסוניים לביופילם במבחנה, קחו שקופית עם תעלה המכילה ביופילם של Staphylococcus aureus - פתוגן אופורטוניסטי. החיידקים המהונדסים מבטאים חלבון פלואורסצנטי לזיהוי מיקרוסקופי. התעלה מתחברת למאגרים מלאים במדיה כדי לספק חומרי הזנה לחיידקים.

הוסף תרחיף של נויטרופילים המסומן בצבע עוקב אחר תאים פלואורסצנטיים. המדיום מכיל גם אתידיום הומודימר, שמכתים את ה-DNA של התאים המתים. דגירה בתנאים פיזיולוגיים.

קולטני זיהוי הדפוסים על נויטרופילים נקשרים לדפוסים המולקולריים הקשורים לפתוגן על החיידקים. הקישור גורם לנויטרופילים לפגוציטוזה של החיידקים ולייצר מיני חמצן תגובתיים חוץ-תאיים או ROS, ולהרוג את החיידקים.

כדי להתחמק מהתגובה החיסונית, חיידקים משחררים אנזימים לניקוי רעלים שמפחיתים את רעלן ה-ROS והלוקוצידין שגורם למוות של תאים. לוקוצידין מונומרי נקשר לקולטנים ספציפיים על הנויטרופילים ועובר מולטימריזציה ליצירת נקבוביות, משבש את שלמות הממברנה והורג את התאים.

האתידיום הומודימר נכנס דרך קרום התא הפגוע, ומכתים את התאים המתים.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב, תת-קבוצה של תאי חיידקים ונויטרופילים נראים מתים, מה שמעיד על אינטראקציה בין נויטרופילים לביופילם.

השתמש בזן פלואורסצנטי של S. aureus, כגון USA300 המבטא GFP, כדי להקל על הדמיית מיקרוסקופיה. דגירה על נויטרופילים עם 100 מיקרו-מולרי BCD למשך 30 דקות בנדנדה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני אטמוספרי. ודא שהדגימות מודגרות בחושך והגבל את החשיפה לאור.

כדי לשטוף עודפי BCD, צנטריפוגה נויטרופילים ב-270 RCF למשך חמש דקות, ושואבים את הסופרנטנט. השעו מחדש את הנויטרופילים ב-HBSS טרי. לאחר מכן, הוסף אתידיום הומודימר-1 לנויטרופילים המוכתמים ב-BCD בריכוז סופי של 4 מיקרומולר כדי לנטר נויטרופילים ומוות חיידקים.

שטפו את הביופילם עם HBSS, והוסיפו 150 מיקרוליטר של נויטרופילים לביופילם S. aureus שגדל במיקרו-שקופיות. דגרו את המיקרו-שקופיות בתא לח למשך 30 דקות. מספר תאי החיידקים יתבסס על ספירת התאים המתקבלת מציפוי הביופילם של 18 שעות.

דמיין את האינטראקציה של ביופילם נויטרופילים באמצעות תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לצבעים פלואורסצנטיים או אורכי גל עירור ופליטה של חלבונים.