הערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי של קטעי רקמת המעי הגס

בעכברים, שכבת רירית המעי הגס מורכבת מתאי חיסון המכילים למינה פרופריה, מוקפים באפיתל ארוז היטב המגן על הרירית. טיפול כימי בנתרן גופרתי דקסטרן משבש צמתים הדוקים, גורם לנזק לתאי האפיתל ומאפשר לחיידקים לומינליים לחדור ללמינה פרופריה.

זיהוי מיקרוביאלי במעי הגס מעורר הפרשת כימוקין, מה שמוביל לחדירה של תאי חיסון ולשחרור ציטוקינים פרו-דלקתיים. התגובה החיסונית המוגזמת הזו גורמת לדלקת במעי הגס או לקוליטיס.

כדי להעריך קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים, התחל עם מגלשת זכוכית הנושאת קטע קבוע ומטופל מראש של רקמת המעי הגס של העכבר המציג קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים. טפל בקטע עם קוקטייל של נוגדנים ראשוניים ספציפיים לקולטנים של תאי חיסון הנקשרים לתאי החיסון שלהם.

יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. דגרו על קטע הרקמה עם נוגדנים משניים ביוטיניליים, הנקשרים במיוחד לנוגדנים הראשוניים. דגירה עם מצומדים של אנזים סטרפטווידין, המקיימים אינטראקציה עם ביוטינים, ויוצרים קומפלקסים.

כיסו את קטע הרקמה במצע כרומוגני; האינטראקציה בין אנזים למצע מעניקה צבע חום לתאי החיסון. מכתים את החלק בצבע המטוקסילין כדי להכתים את גרעיני התא.

התבונן בשקופית המוכתמת תחת מיקרוסקופ. שפע תאי החיסון החומים באזור הפגוע מעיד על קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים.

לניתוח אימונוהיסטוכימי, לאחר חימום החלקים למשך 20 דקות על הפלטה החמה, יש לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות לכל שטיפה, ולחסל את הפרוקסידאז האנדוגני עם דגירה של 10 דקות של מי חמצן 3%.

בתום הדגירה, שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS כפי שהודגם, וחסמו כל קשירה לא ספציפית עם מאגר חוסם, למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את המאגר החוסם בקוקטייל הנוגדנים העיקרי המעניין לדגירה של לילה ב-4 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, שאפו את תמיסת הנוגדנים הראשונית העודפת, ושטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS. לאחר השטיפה האחרונה, דגרו את השקופיות עם קוקטייל הנוגדנים המשני המתאים לביוטינילציה ואחריו תיוג עם קומפלקס פרוקסידאז חזרת סטרפטווידין בטמפרטורת החדר.

כדי לדמיין את התאים המגיבים למערכת החיסון, סמן את הדגימות ב-DAB עד שמתפתח צבע חום בהיר או כהה וצבוע את החלקים בהמטוקסילין ו-0.3% אמוניה מדוללת.

כאשר השקופיות התייבשו, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לקבל תמונות שדה בהיר של חלקי הרקמה בהגדלה של פי 10, והשתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי לזהות ולכמת את אוכלוסיית תאי החיסון המסומנים הן באפיתל והן בלמינה פרופריה.