הריגת תאי K562 על ידי תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם שנחשפו לתכשירי מוצרי טבק

תאי גידול מפעילים תאי חיסון אפקטורים כדי לשחרר ציטוקינים וגרגירים ציטוליטיים המכילים פרפורין וגרנזימים. פרפורין יוצר נקבוביות בקרום תא הגידול, מקל על כניסת גרנזים לתא ויוזם אפופטוזיס, וגורם למוות של תאים.

כדי לנתח את התפקוד הציטוליטי של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי, PBMCs, לאחר הכנת מוצרי טבק, TPP, חשיפה, לוקחים צלחת מרובת בארות עם ריכוזי TPP הולכים וגדלים. באר המכילה מדיום משמשת כבקרה.

הוסף מתלה PBMC. החומר המדכא החיסוני העיקרי של TPPs, ניקוטין, נקשר לקולטני האצטילכולין הניקוטיניים של PBMCs, ומווסת את ייצור הציטוקינים הפרו-דלקתיים.

צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant המכיל TPP. להשעות את ה-PBMCs בתקשורת. הוסף לבארות תאי K562 בעלי תווית פלואורסצנטית, תאים לוקמיים אנושיים בעלי רגישות מוגברת לציטוטוקסיות של תאי אפקטור PBMC.

תאי אפקטור שטופלו ב-TPP עם תגובות חיסוניות מדוכאות מציגים ביטוי מופחת של פרפורין ושחרור ציטוקינים, מה שמפחית את היכולת הציטוליטית של ה-PBMC.

צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים במאגר ואחריו צבע פלואורסצנטי אטום לתאים. הצבע נכנס לתאים עם ממברנות שנפגעו ומכתים את ה-DNA.

בעזרת ציטומטר זרימה, קבע את שיעור תאי K562 המתים והחיים בבארות. אחוז נמוך יותר של תאי K562 מתים בבארות עם ריכוזי TPP גבוהים יותר מאשר הביקורת מצביע על דיכוי הרג תאי K562 על ידי PBMCs שטופלו ב-TPP.

לאחר הכנת צלחת PBMCs שטופלו במוצרי טבק, כפי שהודגם זה עתה, שטפו תרבית של תאי K562 שנקטפו במפגש של 80% ב-10 מיליליטר DPBS. השעו מחדש את הגלולה ב-5 מיליליטר DPBS, וספרו את התאים. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של תמיסת עבודה CFSE שהוכנה טרי ל-1 עד 2 פעמים 10 לתאי K562 השביעיים ב-1 מיליליטר של מדיום שלם, ופזר את כתם התא על ידי מערבולת.

דגירה על התאים בטמפרטורת החדר. לאחר 2 דקות בדיוק, הוסיפו 200 מיקרוליטר FBS, ומערבלו שוב את התאים, ודגרו עליהם למשך שתי דקות נוספות.

לאחר הדגירה השנייה יש לשטוף את התאים ב -10 מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה בעוד 10 מיליליטר של מדיום שלם וספרו את התאים. כעת, צנטריפוגה את ה-PBMCs שטופלו בטבק, ושפכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, החלף את המכסה, השהה מחדש את התאים על ידי מערבולת ושטוף אותם ב -200 מיקרוליטר של מדיום שלם לבאר.

כדי להתחיל את בדיקת ההרג, הוסף את תאי K562 המסומנים ב-CFSE ל-PBMCs ביחס של 1 עד 15, ודגר את התרבות המשותפת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר חמש שעות, סובבו את התאים והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הכדורים על ידי מערבולת, ולאחר מכן שטפו את התאים עם 200 מיקרוליטר של חיץ רץ לבאר. לאחר מכן, הוסף 95 מיקרוליטר של מאגר רץ ואחריו 5 מיקרוליטר של 7-AAD, לנפח כולל של 100 מיקרוליטר לבאר.

לבסוף, דגרו את התאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר רץ לכל באר, והעבירו את כל הנפח לצינורות ה-FACS המתאימים כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים ל-7-AAD ו-CFSE על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי.