ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה

קח צלחת מרובת בארות המכילה תרבית מקרופאגים. להדביק עם ליסטריה מונוציטוגנס המבטא חלבון פלואורסצנטי, Lm.

חלבונים על Lm נקשרים לקולטני מקרופאגים ספציפיים, ומפנימים את החיידקים בתוך פגוזום. בנוסף, Lm מפריש רעלנים יוצרי נקבוביות המשבשים את קרום הפגוזום, ומשחררים חיידקים לתוך הציטוזול, שם הם משתכפלים ומוקפים בחוטי אקטין מארחים.

חלבוני ה-ActA הגורמים להרכבת אקטין על Lm גורמים לפילמור אקטין מתמשך בקצה האחורי של החיידק. זנב שביט האקטין שנוצר מניע את Lm דרך הציטוזול וחודר לקרום תא המקרופאגים, ומשחרר Lm עטוף אקטין מפולימר למדיה.

לאחר הדגירה, אסוף וקבע את המדיה החוץ-תאית, הקשורה לאקטין, המכילה Lm ממערכת בארות. תקן את ה-Lm באמצעות פרפורמלדהיד. הוסיפו מים מזוקקים, קרעו את המקרופאגים ושחררו את ה-Lm התוך-תאי. אסוף את ה-Lm התוך-תאי ותקן את הדגימה באמצעות פרפורמלדהיד.

בבארות אחרות, החלף את המדיה במדיה המכילה גנטמיצין אטומה לתאים כדי לחסל Lm חוץ-תאי. מחליפים במדיה טרייה ודוגרים לתקופה הרצויה.

לאחר הדגירה, אסוף את המדיה המכילה Lm החוץ-תאית וקבע את הדגימה עם פרפורמלדהיד. השתמש במים מזוקקים כדי להשיג ליזאט המכיל Lm תוך-תאי ולתקן את הדגימה עם פרפורמלדהיד. הוסף לדגימות פלואידין עם תווית פלואורסצנטית, שנקשר באופן סלקטיבי לאקטין מפולימר.

בעזרת ציטומטר זרימה, דמיין אותות פלואורסצנטיים מ-Lm ופאלודין קושר אקטין בדגימות. כמת את ה-Lm הקשור לאקטין חוץ-תאי ותוך-תאי שמקורו במקרופאגים הנגועים.

בעזרת מונה תאים אוטומטי, התאם את תאי ה-RAW 264.7 המוכנים לריכוז של 1 x 10⁶ תאים למיליליטר. הוסף 1 מיליליטר מהדגימה לבארות של צלחת תרבית רקמות בת 6 בארות. להדביק את התאים בחיסון Lm מוכן המתאים לריבוי זיהום של 50.

ב-1.5 שעות לאחר ההדבקה, בצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מילימטר מלא ב-500 מיקרוליטר של 4% PFA, אספו מדיה מהסט הראשון של הבארות והניחו את הצינור על קרח. כדי לאסוף Lm תוך תאי, הוסף 1 מיליליטר מים סטריליים מזוקקים לכל באר. לאחר 60 שניות, העבירו את ליזאט המים שנוצר לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של 4% PFA. מערבל את הצינור במרץ במשך 10 שניות והניח אותו על קרח.

עבור הבארות הנותרות, הסר את המדיה והחלף ב-1 מיליליטר DMEM/FCS עם 5 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין כדי להרוג Lm חוץ-תאי.

לאחר 30 דקות, הסר את המדיה והחלף ב-DMEM/FCS ללא גנטמיצין. לאחר שעתיים וארבע שעות נוספות, אספו מדיה בליזטים בפעם השנייה והשלישית לתוך הצינורות והניחו אותם על הקרח לצינון. צינורות צנטריפוגה ב -10,000 פעמים גרם למשך 7 דקות.

בעזרת פיפטה, הסר את ה-supernatant מבלי להפריע לגלולה. הוסיפו לתוך הצינור קוקטייל מכתים המכיל 50 מיקרוליטר של 4% PFA ו-15 מיקרוליטר פלואידין, וערבבו כדי להשעות מחדש כל כדור. דגרו צינורות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה, הוסף 1 מיליליטר של מאגר FACS לכל צינור ופיפטה למעלה ולמטה לערבוב. סובב צינורות בצנטריפוגה ב -10,000 פעמים גרם למשך 7 דקות. הסר את ה-supernatant מבלי להפריע לגלולה.

לשימוש מיידי, השעו כל כדור ב-400 מיקרוליטר של מאגר FACS. אם מאחסנים לניתוח מאוחר יותר, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS, ו-200 מיקרוליטר של 4% PFA לתוך הצינור וערבב לתלייה.