זיהוי הפעלה דלקתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

כדי לזהות קולטן דמוי NOD P3, או NLRP3, הפעלת דלקת, קח צלחת מרובת בארות המכילה מקרופאגים מופעלים המבטאים חלבוני NLRP3.

טפל בתאים במדיה המכילה יונופורים וגליצין. יונופורים גורמים לפליטת יוני אשלגן, מפעילים ומאוליגומרים של חלבוני NLRP3. NLRP3 אוליגומרי מגייס חלבוני מתאם, מה שמקל על הקישור של פרו-קספאז-1, ויוצר את קומפלקס הדלקת NLRP3.

על הדלקת, קרבה מפעילה מחשוף אוטומטי פרו-קספאז-1, משחררת קספזות פעילות, יוזמת פירופטוזיס ועיבוי גרעיני. בנוסף, גליצין מייצב את מבנה התא ומונע ליזה של תאים.

טפל במקרופאגים עם בדיקות מדווח פלואורסצנטיות המכילות קבוצת קשירה של קספאז-1 ופלואורופור המקושר באמצעות רצף חומצות אמינו. ה-caspase-1 המופעל מזהה את רצף חומצות האמינו של הגשושית ונקשר לקבוצת קשירת הקספאז שלה, מה שמאפשר את ההדמיה שלה.

תקן את התאים וכסה אותם בצבע פלואורסצנטי כדי להכתים את הגרעינים. תמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ספור מקרופאגים עם גרעינים מעובים כחולים ומוקדים פלואורסצנטיים ירוקים של קספאז-1 מופעל, מה שמרמז על הפעלת דלקת NLRP3.

התחל בהחלפת המדיום ממקרופאגים שמקורם במח עצם עם LPS שנזרעו על כיסויי זכוכית ב-290 מיקרוליטר של מדיום DMEM-5 בתוספת 5-מיקרו-מולרי ניגריצין ו-5 מילי-מולרי גליצין לבאר. החזר את צלחת 24 הבארות לחממת תרבית התאים למשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, ו