זיהוי הפעלה דלקתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

כדי לזהות קולטן דמוי NOD P3, או NLRP3, הפעלת דלקת, קח צלחת מרובת בארות המכילה מקרופאגים מופעלים המבטאים חלבוני NLRP3.

טפל בתאים במדיה המכילה יונופורים וגליצין. יונופורים גורמים לפליטת יוני אשלגן, מפעילים ומאוליגומרים של חלבוני NLRP3. NLRP3 אוליגומרי מגייס חלבוני מתאם, מה שמקל על הקישור של פרו-קספאז-1, ויוצר את קומפלקס הדלקת NLRP3.

על הדלקת, קרבה מפעילה מחשוף אוטומטי פרו-קספאז-1, משחררת קספזות פעילות, יוזמת פירופטוזיס ועיבוי גרעיני. בנוסף, גליצין מייצב את מבנה התא ומונע ליזה של תאים.

טפל במקרופאגים עם בדיקות מדווח פלואורסצנטיות המכילות קבוצת קשירה של קספאז-1 ופלואורופור המקושר באמצעות רצף חומצות אמינו. ה-caspase-1 המופעל מזהה את רצף חומצות האמינו של הגשושית ונקשר לקבוצת קשירת הקספאז שלה, מה שמאפשר את ההדמיה שלה.

תקן את התאים וכסה אותם בצבע פלואורסצנטי כדי להכתים את הגרעינים. תמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ספור מקרופאגים עם גרעינים מעובים כחולים ומוקדים פלואורסצנטיים ירוקים של קספאז-1 מופעל, מה שמרמז על הפעלת דלקת NLRP3.

התחל בהחלפת המדיום ממקרופאגים שמקורם במח עצם עם LPS שנזרעו על כיסויי זכוכית ב-290 מיקרוליטר של מדיום DMEM-5 בתוספת 5-מיקרו-מולרי ניגריצין ו-5 מילי-מולרי גליצין לבאר. החזר את צלחת 24 הבארות לחממת תרבית התאים למשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והוסף 10 מיקרוליטר של 30X FAM-YVAD-FMK לאחר 15 הדקות הראשונות.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר PBS קר לבאר שלוש פעמים למשך 5 דקות לכל שטיפה, ולתקן את התאים עם 250 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד לבאר למשך 30 דקות על קרח, מוגנים מפני אור, ולסמן את התאים בצבע גרעיני פלואורסצנטי מתאים במהלך חמש הדקות האחרונות.

בתום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כפי שהודגם זה עתה, וטענו כל שקופית ב-7 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה. הנח כיסוי על כל שקופית, ואפשר למדיום ההרכבה להתקשות למשך הלילה לפני איטום הכיסויים עם לק.

כדי לדמות את התאים במיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית, הנח את שקופית הבקרה הלא מטופלת על שלב המיקרוסקופ, והתמקד ידנית בתאים. באמצעות הגדרות טבלת החיפוש של המיקרוסקופ, התאם את ההיסט עד שלא נצפתה עמידת בדיקה חיובית בתאים הלא מטופלים.

לאחר מכן, באמצעות דגימה שטופלה בניגריצין, אתר שדה המכיל תאים חיוביים ושליליים כאחד לצביעה של הבדיקה, והתאם את מישור ההדמיה של תעלת הבדיקה למישור בעל העוצמה הגבוהה ביותר של צביעה חיובית. לאחר מכן, התאם את הרווח עד שהמוקדים נראים בתאים עם גרעינים מעובים, וקבל תמונות של חמישה שדות שנבחרו באקראי לכל שקופית בהגדלה כוללת של פי 100.