אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:06 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בצלחת המכילה תרבית של מקרופאגים ראשוניים.
הכנס ליפופוליסכריד חיידקי, LPS, שנקשר לקולטנים דמויי טול על מקרופאגים, ומפעיל ויסות מוגבר של תחום פירין ממשפחת NLR המכיל 3 או NLRP3.
הוסף יונופור המתווך את שטף יוני האשלגן. ירידה באשלגן ציטוזולי מפעילה את NLRP3. NLRP3 מופעל אוליגומר וגורם לגיוס של חלבון מתאם, אשר בתורו מגייס פרו-קספאז-1, ויוצר דלקת.
פרוטאוליזה אוטומטית ממירה פרו-קספאז-1 לקספאז-1 פעיל, המתווך מוות דלקתי של תאים או פירופטוזיס. נזק ל-DNA במהלך פירופטוזיס מוביל לעיבוי גרעיני.
תקן את התאים וטפל בחומר ניקוי כדי לחדור אותם.
הוסף נוגדן ראשוני הנקשר לחלבון המתאם הקשור לדלקת, ונוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית שנקשרים לנוגדנים הראשוניים, ומסמנים את הדלקת.
הציגו כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית כדי לסמן את הגרעין. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תאים מציגים גרעינים מעובים - המעידים על פירופטוזיס - ומוקדים של חלבונים מתאמים - המעידים על היווצרות דלקתית.
לניתוח אימונופלואורוכימי של התאים שטופלו בניגריצין, שטפו את התאים המסומנים בבדיקה, ודגרו את התאים ב-250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע וחדירה לבאר למשך 30 דקות על קרח, מוגנים מפני אור.
שטפו את המקרופאגים שלוש פעמים נוספות עם מאגר שטיפה טרי, וסמנו את התאים ב-250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני כנגד חלבון דמוי כתם הקשור לאפופטוזיס המכיל תחום גיוס קספא
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים