טכניקת מבחנה לחקר היווצרות קומפלקס דלקתי במקרופאגים

התחל בצלחת המכילה תרבית של מקרופאגים ראשוניים.

הכנס ליפופוליסכריד חיידקי, LPS, שנקשר לקולטנים דמויי טול על מקרופאגים, ומפעיל ויסות מוגבר של תחום פירין ממשפחת NLR המכיל 3 או NLRP3.

הוסף יונופור המתווך את שטף יוני האשלגן. ירידה באשלגן ציטוזולי מפעילה את NLRP3. NLRP3 מופעל אוליגומר וגורם לגיוס של חלבון מתאם, אשר בתורו מגייס פרו-קספאז-1, ויוצר דלקת.

פרוטאוליזה אוטומטית ממירה פרו-קספאז-1 לקספאז-1 פעיל, המתווך מוות דלקתי של תאים או פירופטוזיס. נזק ל-DNA במהלך פירופטוזיס מוביל לעיבוי גרעיני.

תקן את התאים וטפל בחומר ניקוי כדי לחדור אותם.

הוסף נוגדן ראשוני הנקשר לחלבון המתאם הקשור לדלקת, ונוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית שנקשרים לנוגדנים הראשוניים, ומסמנים את הדלקת.

הציגו כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית כדי לסמן את הגרעין. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תאים מציגים גרעינים מעובים - המעידים על פירופטוזיס - ומוקדים של חלבונים מתאמים - המעידים על היווצרות דלקתית.

לניתוח אימונופלואורוכימי של התאים שטופלו בניגריצין, שטפו את התאים המסומנים בבדיקה, ודגרו את התאים ב-250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע וחדירה לבאר למשך 30 דקות על קרח, מוגנים מפני אור.

שטפו את המקרופאגים שלוש פעמים נוספות עם מאגר שטיפה טרי, וסמנו את התאים ב-250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני כנגד חלבון דמוי כתם הקשור לאפופטוזיס המכיל תחום גיוס קספאז C-terminal, או ASC, לבאר למשך שעה אחת על קרח.

שטפו את התאים בתום הדגירה, וסמנו את הדגימות ב-250 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המצומד בצבע פלואורסצנטי מתאים למשך שעה נוספת על קרח, והוסיפו 4 מיקרוליטר של צבע צביעה גרעיני פלואורסצנטי מתאים במהלך 5 הדקות האחרונות.

לאחר שטיפת התאים 3 פעמים במאגר כביסה קרה, הרכיבו כיסויים על השקופיות עם 7 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה כפי שהודגם, ודמו את המקרופאגים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית.