בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז לאיתור מוות מקרופאגים בעקבות חשיפה לניגריצין

קח צלחת בדיקה המכילה מקרופאגים עם ליפופוליסכריד.

תחול מגביר את הביטוי של מבשרי ציטוקינים פרו-דלקתיים לא פעילים וחלבוני NLRP3.

הוסף ניגריצין, יונופור אשלגן, המקדם פליטת יונים. זה משבש את רמות האשלגן התוך תאי, ומפעיל חלבוני NLRP3, ליצירת קומפלקס גדול.

NLRP3 אוליגומרי מגייס את חלבוני המתאם, ASC, וגורם לפילמור שלהם. חוטי ASC מגייסים פרו-קספאז-1, ויוצרים NLRP3-inflammasome, קומפלקס מולטי-חלבון.

Pro-caspase-1 עובר הפעלה אוטומטית המושרה על ידי קרבה, ויוצר caspase-1. Caspase-1 מבקע את הציטוקין הפרו-דלקתי ואת חלבון הגסדרמין-D, ויוצר נקבוביות קרום פלזמה.

התוצאה היא הפרשת ציטוקינים ומוות תאי מתוכנת דלקתי, פירופטוזיס, שחרור תוכן תוך תאי, כולל לקטט דהידרוגנאז, או LDH. אסוף את הסופרנטנט המכיל LDH.

הוסף תערובת מצע - לקטט, יודוניטרוטראזוליום סגול, או צבע INT, NAD+ ודיאפוראז. LDH מחמצן לקטט לפירובט תוך הפחתת NAD+. דיאפוראז מזרז את הפחתת ה-INT, ויוצר פורמזאן בצבע אדום.

עוצמת הצבע תואמת לשחרור LDH, כאשר רמות גבוהות מצביעות על נזק מוגבר לתאים הקשורים לפירופטוזיס ומוות.

כדי לבצע בדיקת שחרור LDH, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום DMEM-5 בתוספת 10 ניגריצין מיקרו-מולרי לכל באר ניסוי, ו-50 מיקרוליטר של DMEM-5 לבארות בקרת הליזיס הספונטניות ו-100% ליזה למשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר 30 דקות הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה פי 10 לבארות בקרת הליזיס של 100%, והוסף 10 מיקרוליטר של מדיום לבארות האחרות. בסוף הדגירה צנטריפוגה את הצלחת, והעבירו 50 מיקרוליטר סופרנטנט מכל באר לצלחת שקופה עם תחתית שטוחה.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מצע טרי מופשר ומוכן לכל באר למשך 30 דקות דגירה בחושך, ובדוק את הצלחת לאחר 15 דקות כדי לוודא שהאות לא יחרוג ממגבלת הזיהוי של קורא הצלחות. בתום הדגירה יש להוסיף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר, ולמדוד את ה-OD₄₉₀ על קורא צלחות מתאים כדי לאפשר חישוב של אחוז ליזיס התאים לבאר.