$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה נויטרופילים עם תווית פלואורסצנטית וטפל בהם בסרום מטופל המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים.
נוגדנים אלה מקיימים אינטראקציה עם קולטני ה-Fc של הנויטרופיל, מפעילים מסלול איתות, מייצרים מיני חמצן תגובתיים או ROS ומפעילים פפטידיל ארגינין דימינאז.
ROS גורם לדה-גרנולציה של נויטרופילים, ומשחרר אנזימים - אלסטאז ומיאלופרוקסידאז לתוך הציטופלזמה. אנזימים אלה ופפטידיל ארגינין דימינאזות מופעלות עוברים לגרעין.
אלסטאז מבקע את היסטון-H1, ומיאלופרוקסידאז משנה היסטונים, ומתחיל עיבוי כרומטין. פפטידיל ארגינין דימינאז מופעל גורם להיסטון ציטרולינציה, ממיר שאריות ארגינין לציטרולין ותורם להמשך העיבוי.
הכרומטין המעובה מתערבב עם חלבונים תוך-תאיים, כולל חלבונים אנטי-מיקרוביאליים וציטופלזמיים. מאוחר יותר, קרום הנויטרופיל מתפרק, ומשחרר כרומטין מפורק מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים לחלל החוץ-תאי, ויוצר מלכודת חוץ-תאית נויטרופילית, NET.
הוסף צבע DNA אטום לתאים, הקשור אך ורק ל-DNA חוץ-תאי ב-NETs. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, נויטרופילים מופיעים באדום עם מבנים ירוקים דמויי רשת חוץ-תאיים, המאשרים היווצרות NET.
צור תרחיף תאים בצפיפות של 420,000 תאים למיליליטר במדיום RPMI-1640 נטול אדום פנול המכיל 2% FCS. הוסף 37,500 נויטרופילים ב-90 מיקרוליטר לכל באר של צלחת שחורה עם תחתית שטוחה של 96 בארות.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מהגירוי הנבחר, במשולש, כדי להגיע לריכוז של 10% בכל באר. כלול תמיד פקד שלילי בשלוש עותקים. דגירה בחושך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי, שנע בין 30 דקות לשעתיים, 4 או 6 שעות. לאחר מכן, הכינו את נפח צבע ה-DNA האטום הדרוש להוספת 25 מיקרוליטר של צבע DNA אטום של 5 מיקרו-מולרי כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרו-מולר בכל באר.
15 דקות לפני תום זמן הדגירה, הוסף 25 מיקרוליטר של צבע DNA אטום של 5 מיקרומולרי לכל באר. המשיכו את הדגירה במשך 15 הדקות האחרונות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט בזהירות רבה ואחסן במידת הצורך. הוסף 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד. שמור את הצלחת בחושך, והמשך מיד לסעיף הבא.
לאחר קביעת התצורה של ההגדרות, בחר סדרת Z. בחר 10 כמספר הצעדים. בחר 3 מיקרומטר כגודל הצעד. טען את הצלחת למיקרוסקופ הקונפוקלי האימונופלואורסצנטי.
לחץ על הכרטיסייה הפעלה. מלא את השם והתיאור של לוחית הרישוי ובחר את מיקום האחסון. בחר את הבארות שצריך לרכוש. בחר את זמן החשיפה עבור טקסס רד ו-FitC, ולאחר מכן לחץ על רכוש צלחת והתחל את הרכישה, שתיקח כשעה לכל צלחת.
לאחר מכן, בחר ניתוח מאקרו. לאחר מכן, בחר W1 ובחר את ערך הסף. לאחר מכן, בחר את ערך הפיקסלים הרצוי, ולבסוף, בחלון ImageJ שני, בחר W2 ובחר את ערך הסף עם ערך הפיקסלים הרצוי. בחרו יעד לקובץ הגיליון האלקטרוני. הפעל את הניתוח ושמור את קובץ יומן הרישום לאחר מכן.