אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:25 דק׳ • July 8th, 2025
קח צלחת מרובת בארות המכילה מקרופאגים.
הוסף Cryptococcus neoformans לבארות הבדיקה, בעוד שבארות הבקרה מכילות רק מקרופאגים.
מקרופאגים פטריות פגוציטוז בתוך פגוזומים.
שוטפים עם חיץ כדי להסיר פטריות שאינן פגוציטוזיות. הוסף מדיה ללא אנטיביוטיקה. דגירה.
הפגוזום מתמזג עם הליזוזום ויוצר פגוליזוזום. פטריות מווסתות את ה-pH של פגוליזוזום ויש להן מנגנונים מהותיים לשרוד בתנאים פגוליזוזומליים קשים. פטריות מחלחלות לקרום הפגוליזוזומי ומשתכפלות, מלווה בהצטברות ציטוזולית של שלפוחיות מלאות בפוליסכרידים.
מגורים ושכפול פטרייתי תוך-תאיים גורמים לנזק תאי, ומפעילים מסלולי מוות תאי. זה גורם לליזה של מקרופאגים ושחרור תוכן תוך תאי, כולל לקטט דהידרוגנאז או LDH, למדיה.
אסוף מדיה המכילה LDH בנקודות זמן שונות. ליז את מקרופאגי הבקרה בנקודות זמן דומות לשחרור LDH תאי מקסימלי. הוסף את תערובת הבדיקה למדיה שנאספה ולליזטים. LDH ממיר לקטט לפירובט, ומפחית את NAD+. דיאפוראז מפחית מלח טטרזוליום ויוצר מוצר פורמזן אדום.
בעזרת קורא צלחות, מדוד את ספיגת הפורמזאן כדי לכמת ליזיס מקרופאגים בעקבות זיהום Cryptococcus neoformans.
כדי להכין תאים פטרייתיים לזיהום במקרופאגים, יש לאסוף ולצנטריפוגה תאי C. neoformans מתרבית שלב אמצע לוג, ולאחר מכן שלוש שטיפות עדינות עם 1 מיליליטר PBS בטמפרטורת החדר באותם תנאי צנטריפוגה.
לאחר השטיפה האחרונה,
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים