מערכת זיהום חדירה המבוססת על החדרת ממברנה לחקר ההשפעה של רעלנים חיידקיים

קח מערכת זיהום דו-קאמרית המופרדת על ידי הכנסת קרום חדיר. התא התחתון מכיל קרטינוציטים אנושיים דביקים, או תאי עור.

הוסף פתוגנים חיידקיים בתא העליון, ודגר. הממברנה מונעת מגע ישיר של הפתוגנים עם הקרטינוציטים. פתוגנים מפרישים סטרפטוליזין S או SLS - רעלן קטן - החוצה את הממברנה כדי להגיע לתאים.

הטרנספורטר המשותף של נתרן ביקרבונט על קרטינוציטים מתווך את זרם יוני הביקרבונט והנתרן, ושומר על pH תוך תאי. SLS נקשר לטרנספורטר המשותף ומשבש את הובלת היונים, מה שמוביל ללחץ אוסמוטי תוך תאי.

האיתות במורד הזרם המושרה על ידי מתח גורם לפירוק המעכב הקשור לגורם גרעיני-Kappa B מבודד, או NF-κB, מה שמוביל להפעלתו. ה-NF-κB המופעל עובר לגרעין, מה שמוביל לוויסות יתר של ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים.

עם הפרשה חוץ-תאית, הציטוקינים נקשרים לקולטני מוות בתא המארח, ומתחילים נמק. לאחר הדגירה, קצרו את התרבית כדי להעריך את ההשפעה של רעלן החיידקים.

מיד לפני הטיפול, השתמש ב-1X PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, יש למרוח 2 מיליליטר של מדיום גידול טרי עם או בלי טיפול תרופתי על צלחות שש הבארות, או 0.5 מיליליטר מדיום על הבארות של צלחות 24 בארות. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח בזהירות תוספת קרום חדירה סטרילית של 0.4 מיקרון לכל באר.

טיפול עדין וסטרילי בתוספות החדירות במהלך הכנת הזיהום הוא קריטי כדי למנוע מהממברנה להיפגע או להזדהם במהלך תהליך זה.

מרחו מדיום תרבית תאים טרי על החדר העליון של כל באר, על פי הוראות היצרן. לאחר מכן, החל נפח מתאים של תרביות החיידקים המנורמלות על החדר העליון של מערכת הכנסת הממברנה החדירה, והחל מדיום חיידקי על בארות הבקרה.

הוספה זהירה של החיידקים לחדר העליון, כמו גם הובלה עדינה של התאים הנגועים לאינקובטור, הם קריטיים, מכיוון שחיוני שחיידקים לא יזהמו את החדר התחתון במהלך מערך הניסוי.

כדי להעריך חלבוני מארח מופרשים, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר בזהירות את תוספת הממברנה החדירה. לאחר מכן, תוך כדי לא להפריע לשכבת התאים החד-שכבתית, אסוף את המדיום מהתא התחתון לצינורות של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 RCF ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לגלול פסולת תאית. לאחר מכן, הסר את כל הסופרנטנט מלבד 50 מיקרוליטר, העביר לצינור טרי של 1.5 מיליליטר ואחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס, או השתמש מיד.