חילוץ ליזט של תא מארח מתאים מארחים נגועים בתרבית במערכת ממברנות חדירה

התחל בזריעת תאים מארחים של יונקים בתא התחתון של מערכת ממברנה חדירה.

הוסף סטרפטוקוקוס - חיידק פתוגני הידוע כמפריש סטרפטוליזין S או רעלן SLS, לתוספת הממברנה. רעלן SLS מתפזר דרך נקבוביות הממברנה ומגיע לתא המארח.

הקוטרנספורטרים של נתרן-ביקרבונט הקשורים לממברנה מווסתים את הובלת היונים, ושומרים על הומאוסטזיס תאי. הרעלן נקשר לקוטרנספורטרים אלה, משבש את הובלת היונים וגורם ללחץ אוסמוטי בתאי המארח.

זה מפעיל מספר מפלי איתות במורד הזרם, כולל p38 MAPK, מסלול חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן. p38 MAPK מופעל מזרחן את המטרות שלו במורד הזרם, ויוזם תגובה תאית נגד החיידקים.

לאחר מכן, הסר את תוספת הממברנה החדירה. שאפו את המדיום מעל תאי המארח. הוסף מאגר ליזה כדי לשחרר את התוכן הסלולרי. צנטריפוגה כדי לזרוק את פסולת התא.

אסוף את הסופרנטנט המכיל רכיבי ליזאט מסיסים ואת הגלולה המכילה רכיבי ליזאט בלתי מסיסים. אחסן את הדגימות להמשך ניתוח.

מיד לפני הטיפול, השתמש ב-1X PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, יש למרוח 2 מיליליטר של מדיום גידול טרי עם או בלי טיפול תרופתי על צלחות שש הבארות, או 0.5 מיליליטר מדיום על הבארות של צלחות 24 בארות. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע הזרימה הלמינרית, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח בזהירות תוספת קרום חדירה סטרילית של 0.4 מיקרון לכל באר.

טיפול עדין וסטרילי בתוספות החדירות במהלך הכנת הזיהום הוא קריטי כדי למנוע מהממברנה להיפגע, או להזדהם, במהלך תהליך זה.

מרחו מדיום תרבית תאים טרי על החדר העליון של כל באר בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, החל נפח מתאים של תרביות החיידקים המנורמלות על החדר העליון של מערכת הכנסת הממברנה החדירה והחל מדיום חיידקי על בארות הבקרה.

הוספה זהירה של החיידקים לחדר העליון, כמו גם הובלה עדינה של התאים הנגועים לאינקובטור, הם קריטיים, מכיוון שחיוני שחיידקים לא יזהמו את החדר התחתון במהלך מערך הניסוי.

השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר בזהירות את תוספת הממברנה החדירה.

להערכת ליזטים של תא מארח, שאפו בעדינות את המדיום מעל החד-שכבתי מבלי להפריע לתאי המארח. לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת. שאפו בעדינות את ה-PBS, ומרחו מיד נפח של מאגר ליזה קר כקרח כדי להשיג, למשל, ריכוז חלבון של 0.5 עד 1.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, דגרו את הדגימות על קרח למשך 15 דקות.

לאחר מכן, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים משטח הצלחת של כל באר, ולהעביר את כל התוכן של כל באר לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 RCF ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

כדי להעריך רכיבי ליזאט מסיסים, העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי, ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס, או השתמשו מיד. כדי להעריך רכיבי ליזאט גרעיניים או בלתי מסיסים אחרים, שמור את הגלולה ואחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס, או השתמש מיד.