זיהוי היצמדות חיידקים לתאים מארחים באמצעות דימות פלואורסצנטי

קח צלחת מרובת בארות המכילה תאי אפיתל חד-שכבתיים דביקים הרגישים להיצמדות חיידקים.

הוסף מספרים משתנים של Pseudomonas aeruginosa, חיידק פתוגני המתויג בחלבון פלואורסצנטי, כדי להשיג את היחס הרצוי בין חיידקים לתאי אפיתל.

צנטריפוגה כדי לקרב את החיידקים לתאי האפיתל, מה שמקל על אינטראקציות.

פילי מסוג IV, סיבים חלבונים על החיידקים, ממלאים תפקיד מרכזי על ידי קשירה לגליקוליפידים ספציפיים על תאי האפיתל, ומתווכים את היצמדות החיידקים לתאי המארח.

לאחר הדגירה, יש לשטוף עם חיץ כדי להסיר חיידקים שאינם נדבקים. תקן את התאים כדי לשמר את מבנה התא.

הוסף DAPI, כתם פלואורסצנטי שנקשר חזק לאזורי DNA עשירים ב-A-T, ומכתים את הגרעין. מכסים את התאים במאגר למניעת ייבוש תאים.

רכוש תמונות של החיידקים המסומנים ב-GFP המחוברים לתאי אפיתל עם גרעין מוכתם ב-DAPI. ספרו את החיידקים הדבקים בתא אפיתל יחיד.

הגדלת חיידקים נצמדים לכל תא מארח באופן תלוי מינון, מאפשרת כימות של אינטראקציות מארח-פתוגן.

לבדיקת היצמדות חיידקים, שטפו את חד-שכבות תאי A549 שתורבתו בעבר שלוש פעמים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר PBS חם לכל באר, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה. לאחר מכן, השליכו את PBS. לחלופין, לאחר הוספת PBS, המתן עשר שניות ולאחר מכן, הסר PBS באמצעות ואקום.

כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, יש לכסות את התאים ב -100 מיקרוליטר של ריכוזים רצויים של תרחיף חיידקים עם ריבוי זיהום שונה. סובבו את החיידקים ודגרו על תאי A549 הנגועים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה נוספת. הסר את החיידקים הלא קשורים על ידי שטיפת החד-שכבות חמש פעמים עם PBS חם כפי שהודגם.

לאחר מכן, תקן את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של פורמלדהיד 4% בכל הבארות של צלחת של 96 בארות על הקרח. לאחר 15 דקות יש לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את תמיסת הקיבוע, להכתים את הגרעינים בכתם DAPI של 50 ננוגרם למיליליטר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת התאים ב-PBS, יש לכסות את תאי ה-A549 הנגועים ב-100 מיקרוליטר PBS כדי למנוע ייבוש, ולאחר מכן לאחסן את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס עד יומיים בחושך או להמשיך להדמיה.