טכניקת הדמיה לחקר תגובת הסידן בתאים נגועים בחיידקים

קחו תא הדמיה המכיל תרבית של תאי אפיתל אנושיים טעונים באינדיקטור פלואורסצנטי של סידן תוך-תאי.

הוסף מצע גידול המכיל יוני סידן. הכירו את השיגלה, חיידק פתוגני, ודגרו.

מערכת הפרשת החיידקים חודרת לתא המארח ומשחררת אפקטורים פולשים. פלישה גורמת לסידור מחדש של אקטין, ויוצרת קרום שמשתולל סביב חיידקים.

באתר הפלישה מופעל פוספוליפאז C, או PLC, על קרום הפלזמה, וקולטני אינוזיטול טריפוספט מתקבצים על הרטיקולום האנדופלזמי או ER.

PLC מבצע הידרוליזה של פוספטידילינוזיטול ממברנה 4,5-ביספוספט לאינוזיטול טריפוספט, או IP3, המצטבר באופן מקומי עקב רשת אקטין צפופה.

IP3 נקשר לקולטנים בחדר המיון, וגורם לשחרור סידן. אינדיקטורים לסידן נקשרים ליונים משוחררים ופולטים פלואורסצנטיות, ומציגים תגובת סידן מקומית.

IP3 מתפזר לאט דרך האקטין, מדלדל עוד יותר את רמת הסידן של ER ומפעיל תעלת סידן של קרום פלזמה, מה שמוביל לזרם סידן.

פלואורסצנטיות על פני התא מצביעה על תגובת סידן גלובלית מאוחרת.

הנח את הכיסוי המכיל את תאי Fluo-4 בתא הדמיה או בתחתית זכוכית. השתמש במאגר EM כדי לשטוף את הדגימה שלוש פעמים כדי להסיר תרכובות שעלולות לנבוע מליזיס תאים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר EM. הנח את החדר על במת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, מחומם ב-33 מעלות צלזיוס. בחר שדה מיקרוסקופיה, והגדר פרמטרי רכישה, כולל זמן חשיפה ו-binning, במידת הצורך, כדי לייעל את האות הפלואורסצנטי Fluo-4.

כדי להוסיף חיידקים לדגימה, הסר בזהירות 500 מיקרוליטר של מאגר EM מהתא, והוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים כדי לקבל OD₆₀₀ סופי של 0.05. בצע רכישה באופן מיידי, או המתן 10 דקות כדי לאפשר לחיידקים לשקוע על התאים. בסוף זרם הרכישה, רכשו תמונת ניגודיות פאזה של השדה הנבחר כדי לדמיין את החיידקים היוצרים קשר עם התאים ואת סלסולי הממברנה הקשורים לאתרי פלישת חיידקים.

חזור על הליך הרכישה במרווחי זמן המתאימים למשך רכישת התמונות, שמירת קבצים ובחירת שדה חדש שיכסה את כל התהליך. בתום הליך הרכישה, הוסף לדגימה, שני מיקרוטולר של יונומיצין הסידן יונופור כדי לקבוע את המשרעת המקסימלית של אותות הסידן. קבל תמונות כל 3 עד 5 שניות עד שהאות מתייצב, בדרך כלל למשך פחות מ-10 דקות.

לאחר מכן הוסיפו את כלטור הסידן EGTA לריכוז סופי של 10 מילימולר כדי לקבוע את האות הפלואורסצנטי בהיעדר סידן. קבל תמונות כל 3 עד 5 שניות עד לייצוב האות, בדרך כלל למשך פחות מ-10 דקות. בצע ניתוח תמונה על פי פרוטוקול הטקסט.