ניתוח סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ותאי ראג'י טעונים SEB באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה
JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:28 דק' • July 8th, 2025
קח צינורות ציטומטריית זרימה המכילים תאי ראג'י לא טעונים ותאי ראג'י Staphylococcus aureus enterotoxin B או תאי ראג'י טעונים SEB.
תאי ראג'י אלה טעוני SEB מתפקדים כתאי B חלופיים המציגים אנטיגן המכילים את הסופר-אנטיגן SEB המורכב למולקולות MHC מסוג II.
דגירה עם פאן-לויקוציטים.
קולטני תאי T, TCRs על תאי T נקשרים ל-SEBs בתאי ראג'י, אשר, יחד עם אותות מעוררים משותפים, יוצרים צומת תא-תא יציב, סינפסה חיסונית, המובילה להפעלת תאי T.
זה מפעיל מסלולי איתות תוך-תאיים, הגורמים לסידור מחדש של שלד הציטו של האקטין, עם אשכול של מולקולות איתות וקולטני פני השטח בתוך הסינפסה.
לאחר הדגירה, תקן את התאים כדי לשמר את המבנים התאיים שלהם. לחדור לתאים כדי לגשת למטרות תוך-תאיות.
הוסף נוגדנים נגד CD3 עם תווית פלואורופור, פלואידין ו-DAPI, הנקשרים ל-CD3 בקומפלקס TCR, חוטי אקטין ו-DNA, בהתאמה.
באמצעות ציטומטר זרימת הדמיה, דמיין אותות פלואורסצנטיים מ-CD3 ואקטין כדי לקבוע את העשרתם בסינפסה בנוכחות SEB.
התחל בערבוב מיליליטר אחד של דם היקפי אנושי טרי עם 30 מיליליטר של מאגר ליזה ACK בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר שמונה דקות בטמפרטורת החדר, מלאו את הצינור ב-PBS לשטיפת צנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום תרבית למשך 60 דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
בתום הדגירה, הוסף 5 x 105 Staphylococcus aureus enterotoxin B או SEB טעון או פרקו תאי ראג'י ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לצינורות FACS בודדים, ואחריהם 650 מיקרוליטר של פאן-לויקוציטים. סובב את התרביות המשותפות, והשהה מחדש את הכדורים ב-150 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי למשך 45 דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, מערבל בעדינות את התאים למשך 10 שניות ב-100 סל"ד תוך הוספת 1.5 מיליליטר של 1.5% פרפורמלדהיד. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, הפסק את הקיבוע עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת 1% BSA, ואסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר PBS בתוספת BSA ו-0.1% ספונין, והוסיפו את דגימות התאים לשתי בארות בודדות של צלחת U-bottom של 96 בארות.
לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, יש לצנטריפוגה את הצלחת ולהשעות מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטר PBS בתוספת BSA וספונין, המכילים את הנוגדנים המצומדים בפלואורופור או תרכובות מעניינות למשך 30 דקות דגירה בחושך בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים ב-150 מיקרוליטר PBS בתוספת BSA וספונין, ולהשעות את הכדורים ב-60 מיקרוליטר PBS.
כדי לדמות את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את תוכנת הניתוח, בדוק את מפלס הנוזל ולחץ על התחל בתפריט המכשיר. לאחר מכן, לחץ על טען וטען את הדגימות ליציאה כאשר תתבקש.
תחת הכרטיסייה תאורה, שנה את עוצמת לייזר העירור לאורכי הננומטר המתאימים. לאחר מכן, כוונן את השערים עבור ערוצים 4 ו-11, והתאם את האזור עבור ערוץ 1.
כדי להעריך את התאמות כוח השער והלייזר, העבר את View תפריט לשער המתאים, והתאם את השערים ועוצמות הלייזר עד שהתאים וזוגות התאים נראים לעין. לאחר מכן, בכרטיסייה File Acquisition, הגדר את שם הדגימה ואת מספר התמונות שיש לרכוש, ואת השער המתאים לצביעה של CD3, ולחץ על Acquire כדי להתחיל ברכישה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבדיקת הפעלת תאי T באמצעות תאי Raji הטעונים ב-SEB כתאי B תחליפיים המציגים אנטיגן. התהליך כולל ציטומטריה זרימה כדי להנמיח את היווצרות הסינפסה החיסונית ואת המעורבות של הקולטן של תאי T.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ציטומטריה זרימה
רקע
- ניתן להטעין תאי Raji עם סופראנטיגנים כגון SEB.
- הפעלה של תאי T דורשת הן זיהוי של אנטיגן והן אותות קו-סטימולטוריים.
- סינפסות חיסוניות הן קריטיות לתגובות יעילות של תאי T.
- ציטומטריית זרימה מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות בין תאים.
מטרת המחקר
- לחקירת המנגנונים של הפעלת תאי T.
- לוויזואליזציה של היווצרות סינפסות חיסוניות.
- להערכת תפקידו של SEB במעורבות של קולטן תאי T.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי Raji טעונים ולא טעונים ב-SEB.
- תרבית משותפת של תאי Raji עם פאן-לוקוציטים.
- קיבוע וחדירה (permeabilization) של תאים לצורך צביעה בנוגדנים.
- ניתוח באמצעות ציטומטריה של זרימה להדמיית הדינמיקה של TCR ואקטין.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של סינפסים חיסוניים בין תאי T לתאי Raji הטעונים ב-SEB.
- ויזואליזציה של העשרת CD3 ואקטין בסינפס.
- הדגמה של מסלולי איתות להפעלה של תאי T.
- ניתוח כמותי של תגובות תאי T ל-SEB.
מסקנות
- תאי Raji טעונים ב-SEB מדמים ביעילות תאים מציגי אנטיגן.
- ציטומטריה זרימה היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות של תאי T.
- הבנת הדינמיקה של הסינפסה החיסונית היא קריטית למחקר אימונולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של היווצרות סינפסה חיסונית, אירוע מוקדם וקריטי בהפעלה של תאי T, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בגילוי של אימונו-מודולטורים. באמצעות ויזואליזציה של העשרה של CD3 ואקטין באמצעות ציטומטריית זרימה עם דימיג'ינג (imaging flow cytometry), היא מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור ביולוגיות המכוונות למסלולי סיגנלינג של TCR. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים של מעורבות חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות של סיגנלינג תלוי-TCR באמצעות ויזואליזציה ישירה של היווצרות הסינפסה החיסונית.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אישור של הפעלת תאי T תלוית-אנטיגן וקו-סטימולטורית.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים של מועמדים לאימונומודולטורים באמצעות מדדים סינפטיים כמותיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות תאי T ו-APC המאומתות להמשך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: אספקת קריאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של היווצרות סינפסים לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תמיכה בשימוש בפלטפורמה ניתנת להרחבה בתהליך מעבר מלהיט למוביל (hit-to-lead) עבור אימונומודולטורים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם מערכות הרלוונטיות למחלה באמצעות מידול של אינטראקציות בין תאי T לתאי B אנושיים במסלולים המונעים על ידי סופראנטיגנים.
- ערך מדעי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות דינמיקה כמותית של הסינפסה החיסונית.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי קישור מעורבות מוקדמת של המטרה לתגובות פונקציונליות של תאי T.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות מטרה (target engagement) ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), ובמיוחד עבור אימונומודולטורים ומסייעי חיסון.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של אינטראקציות TCR-pMHC ואינטראקציות קו-סטימולטוריות בהקשרים חיסוניים אנושיים.
- סריקה: מספקת מערכות מוכנות לבדיקה עם פלטי דימות כמותיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדדי העשרה של CD3 ואקטין המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית באמצעות מידול של היווצרות סינפסה חיסונית אנושית in vitro.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לציטומטריה של זרימה עם דימות הניתנת לשימוש חוזר עבור פרופיל חיסוני בתחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהפעלה של תאי T.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של מדידות סינפסה חיסונית בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go באמצעות אספקת קריאות פונקציונליות מוקדמות על יעילותו של אימונומודולטור.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים מותאם סיכון על בסיס נתונים כמותיים של היווצרות סינפסות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונולוגיה, ציטומטריה של זרימה ופרוטוקולי צביעה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה עם דימיון (imaging flow cytometers) ובבקרות פיצוי עבור פאנלים רב-צבעיים.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת התאים ותזמון האינקובציה לצורך זיהוי סינפסיות הדיר בתוצאות הניסוי.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת השיטה לתאי מערכת חיסון ראשוניים או לקווי תאים רלוונטיים למחלה.
- מוגבל על ידי הצורך בתרבויות משותפות (co-cultures) של תאים חיוניים ובתנאי טעינה אופטימליים של SEB לקבלת תוצאות עקביות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית
סרטונים קשורים
0 צפיות
דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics
סרטונים קשורים
0 צפיות
הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T
סרטונים קשורים
0 צפיות
Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס
סרטונים קשורים
0 צפיות
טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות
סרטונים קשורים
0 צפיות
היווצרות סינפסות אימונולוגיות בין תאי T מסייעים לתאים מציגי אנטיגן
סרטונים קשורים
0 צפיות
שימוש בשכבות שומנים הנתמכות על ידי חרוזים כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T
סרטונים קשורים
0 צפיות
קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים
סרטונים קשורים
0 צפיות
מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה
סרטונים קשורים
0 צפיות
ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026