אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 2:36 דק׳ • July 8th, 2025
השג תרבית של מקרופאגים מובחנים לחלוטין בצלחת מרובת בארות. למקרופאגים אלה יש סמנים על פני השטח, כגון קולטנים דמויי טול או TLR-2 - קולטן לזיהוי דפוסים המזהה רכיבים מיקרוביאליים שונים.
הוסף כמות מתאימה של Mycobacterium tuberculosis או תרחיף תאי Mtb המסומן פלואורסצנטי לכל באר ודגירה.
TLR-2 מזהה ליפוארבינומנן, או LAM, מרכיב גליקוליפיד מורכב של דופן התא Mtb, ויוזם פגוציטוזיס. המקרופאג מפנים את Mtb, ומבודד את החיידק בתוך פגוזום - תא הקשור לממברנה.
הפגוזום מתבגר, על ידי התמזגות עם ליזוזומים, ויוצר פגוליזוזום - תא חומצי ועשיר באנזימות.
בתוך הפגוליזוזום, ה-Mtb מעכב את משאבת הפרוטונים מסוג וואקולרי האחראית ליצירת pH חומצי. כתוצאה מכך, ה-pH בתוך הפגוליזוזום הופך לכמעט ניטרלי, ומנטרל אנזימים המפרקים פתוגנים נבלעים.
האינטראקציה בין LAM ל-TLR2, משפיעה גם על מסלולי האיתות של התא המארח, מה שמוביל לאפנון של סמני פני השטח המעורבים בהצגת אנטיגן.
השבתת הפגוליזוזום ועיכוב התגובה החיסונית של המארח מאפשרים ל-Mtb להתקיים ולהשתכפל בתוך המקרופאגים.
כדי להדביק את התאים שמקורם במונוציטים, יש לדלל את החיידקים ל-5 פעמים 10 עד לריכוז המושבה השישית למיליליטר במדיום נטול סרום, ולהחליף את הסופרנטנט בכל באר של צלחת תרבית התאים בת שש הבארות, ב-1 מיליליטר של מדיום טרי נטול סרום ו-1 מיליליטר של תרחיף חיידקים לבאר כדי להשיג ריבוי זיהום של 5.
לאחר דגירה של 4 שעות בחממת תרבית התאים, יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של מאגר כביסה סטרילי לכל שטיפה, ולהטות את הצלחת בזהירות כדי להסיר את כל נפח החיץ מפינות הבארות לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים שמקורם במונוציטים הנגועים ב-MTb ב-2 מיליליטר של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה.