JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:51 דק' • July 8th, 2025
מניחים את רירית רחם צוואר הרחם בצלחת פטרי. הפרד את האקטוצרביקס והרירית האנדוצווארית מהתת-רירית. פורסים את שכבת הרירית לצמחים קטנים יותר ומעבירים אותם לצינור חרוטי.
הוסף את נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1, או HIV-1 לתוך צינור האקספלנט. חלקיקי נגיף ה-HIV-1 מתקרבים לשכבה הרירית החשופה ונקשרים לקולטן CD4 ולקולטן CXCR4 בתא המארח.
עם הקשירה, המעטפת הנגיפית מתמזגת עם קרום התא המארח, ומשחררת קפסיד ויראלי המכיל RNA ויראלי ואנזים טרנסקריפטאז הפוך לתוך הציטופלזמה. בתוך הציטופלזמה, הטרנסקריפטאז ההפוך ממיר את ה-RNA הנגיפי ל-DNA משלים, או cDNA.
ה-cDNA נע לתוך גרעין התא המארח, שם אינטגראז משלב DNA ויראלי בגנום המארח. ה-DNA הנגיפי מכוון את הסינתזה של RNA ויראלי חדש וחלבונים המתאספים לחלקיקי נגיף חדשים. חלקיקים אלה נובטים מהתא המארח, ורוכשים מעטפת שומנים.
שטפו את הצמחים עם מאגר מתאים כדי להסיר כל וירוס לא קשור. לבסוף, הניחו את האקספלנטים על ספוג ג'לטין בצלחת מרובת בארות עם מדיום מתאים ודגרו.
ממשק האוויר-נוזל ממקסם את החשיפה לחמצן ואת הנגישות לחומרים מזינים דרך נימי הספוג, ומשפר את כדאיות המודל לניתוח במורד הזרם.
השתמש במכסה של צלחת הפטרי כמשטח חיתוך כדי לנתח את הרקמה. החזק את הרקמה בעדינות עם מלקחיים, הפרד את הרירית של האקטוצרוויקס ו/או האנדו-צוואר הרחם מהסטרומה והתת-רירית התחתונה בעזרת אזמל ולהב כדי לקבל רצועות רירית. חותכים את הרירית לרצועות ברוחב 2 מילימטר. הסר והשליך כמה שיותר תת-רירית, והשאיר רק שכבת רקמה בעובי 2 מילימטר. לאחר מכן, חותכים את הרצועות לבלוקים בעובי 2 מילימטר.
העבירו רקמות לתוך צלחת פטרי חדשה בגודל 100 מילימטר המכילה 10 עד 20 מיליליטר CMT כדי למנוע ייבוש רקמות תוך כדי המשך הדיסקציה. בסוף הדיסקציה, סובב את הצלחת כדי לחלק את התפלגות הצמח באופן אקראי. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את הצמחים לצינורות חרוטיים סטריליים של 1.5 מיליליטר. הסר כל מדיום בצינור באמצעות פיפטה.
לקבלת תוצאות מיטביות, יש לעבד ולהדביק את חלקי צוואר הרחם בהקדם האפשרי לאחר הניתוח, באופן אידיאלי ביום הניתוח. לחלופין, ניתן לאחסן רקמות שקועות ב-CMT ב-4 מעלות למשך הלילה ולהדביק אותן מיד לאחר הניתוח.
הפשירו את תכשיר ה- HIV-1 באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, העבירו את הנגיף לצינורות המכילים את האקספלנטים. מעבירים את הצינורות לתרמו-שייקר ודוגרים במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, מתנדנדים ב-300 סל"ד. הפוך בעדינות את הצינורות כמה פעמים כל 30 עד 60 דקות.
בינתיים, מלאו צלחת של שש בארות עם 3 עד 4 מיליליטר לבאר של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט. בתום הדגירה עם HIV-1, השתמש בפיפטה כדי להשליך את כל הכנת הנגיף בצינורות המכילים את האקספלנטים למיכל עם תמיסת חיטוי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ובפיפטה כדי להעביר את האקספלנטים לצלחת שש הבארות המכילה PBS.
לאחר שאפשרתם לצמחים לנוח ב-PBS למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, שטפו אותם על ידי פיפטינג עדין של ה-PBS למעלה ולמטה לבאר פעמיים-שלוש. לאחר מכן, השליכו את ה-PBS למיכל עם תמיסת חיטוי באמצעות פיפטה. הוסף 3 עד 4 מיליליטר PBS חדש לכל באר. חזור על הפעולה פעמיים נוספות בסך הכל שלוש כביסות. השליכו את ה-PBS רגע לפני העברת הצמחים לספוגים כדי למנוע ייבוש רקמות.
כעת, השתמש במלקחיים כדי להעביר חמישה עד שמונה צמחים על גבי כל ספוג ג'לטין לצלחת של 12 בארות. החזירו את הצלחת לחממה.