אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:11 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לכמת את האינטרפרונים הביו-אקטיביים מסוג I, כגון אינטרפרון-אלפא ואינטרפרון-בטא, בדגימת בדיקה, קח צלחת מרובת בארות המכילה תאי דיווח מהונדסים. תאים אלה מבטאים את הפוספטאז האלקליין העוברי המופרש, SEAP, גן מדווח בשליטת מקדם האינטרפרון-אלפא ובטא.
הוסף את דגימת הבדיקה המכילה ריכוז אינטרפרון מסוג I לא ידוע. פיפטה טווח של ריכוזי אינטרפרון מסוג I אנושיים לבארות אחרות, הפועלות כבקרות סטנדרטיות. דגירה.
אינטרפרון מסוג I בבאר הבדיקה נקשר לקולטן ספציפי על פני התא, ומפעיל את קינאזות ג'אנוס חלבונים קינאזות אלה מתמרי אותות זרחניים ומפעילים של חלבוני שעתוק, STAT, המתעמעמים ויוצרים קומפלקס עם גורם ויסות אינטרפרון ספציפי.
עם הכניסה לגרעין, הקומפלקס נקשר לרצף DNA ספציפי במקדם השראת אינטרפרון-אלפא ובטא, מפעיל את שעתוק הגן SEAP ומייצר את אנזימי ה-SEAP, המופרשים למדיה.
העבר את המדיה המכילה SEAP לבארות מרובות בארות בעלות מצע ספציפי ל-SEAP. SEAP מבצע הידרוליזה של המצע הוורוד, ומייצר מוצר בצבע סגול-כחול.
באמצעות קורא מיקרו-פלטות, מדוד את ספיגת המוצר בבארות הבדיקה ובבארות הסטנדרטיות, המעיד על רמות SEAP וריכוז אינטרפרון מסוג I.
מעקומת האינטרפרון הסטנדרטית מסוג I המשורטטת, קבע את ריכוז האינטרפרון הביו-אקטיבי מסוג I בדגימת הבדיקה.
כדי למדוד אינטרפרון ביו-אקטיבי מסוג I באמצעות תאי מדווח אינטרפרון-אלפא/בטא HEK-Blue, ראשית, יש לצלחת את תאי הדיווח בצפיפות של 50,000 תאים לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות לנפח סופי של 180 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של סופרנטנט תרבית משותפת שזה עתה נקטף לכל באר בשכפול. כלול סט של בקרות סטנדרטיות פנימיות, ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 18 עד 22 שעות.
כדי לקבוע את רמות הפוספטאז האלקליין המשתחרר מתאי המדווח, הוסף 180 מיקרוליטר של תמיסת QUANTI-Blue לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה חדשה. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של תאי אינטרפרון-אלפא/בטא המושרים HEK-כחול לכל באר, ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עד להתפתחות צבע בבארות הבקרה הסטנדרטיות של אינטרפרון.
תמיסת QUANTI-Blue משתנה מוורוד לסגול-כחול בנוכחות האנזים. לבסוף, השתמש בספקטרופוטומטר כדי להעריך את רמות הפוספטאז האלקליין המופרש ב-620 עד 655 ננומטר ולקבוע את ריכוז האינטרפרון מסוג I על ידי אקסטרפולציה מהחלק הליניארי של העקומה הסטנדרטית של האינטרפרון.